[发明专利]高纯度凝血酶原复合物制品冷冻干燥稳定剂

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，是几种和几组高纯度凝血酶原复合物制品(四种凝血因子II、VII、IX、X比活均≥3.5IU/mg)在冷冻干燥过程，可有效防止制品中主要作用凝血因子IX及凝血因子II、VII、X失活的稳定剂。更详细地说，在高纯度凝血酶原复合物中加入0.1％-10％精氨酸或/和0.1％-10％海藻糖或/和0.1％-10％组氨酸或/和0.1％-10％甘氨酸，在冷冻干燥过程中可有效保护制品凝血因子IX及凝血因子II、VII、X的活性。

背景技术

人凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)是从健康人混合血浆中分离制备成的一种能促进血液凝固的血液制品，主要含有依赖维生素K合成的凝血因子II、VII、IX、X。在临床上，PCC主要用于乙型血友病、凝血因子VII抗体产生的甲型血友病及由肝脏疾病、维生素K缺乏所引起的凝血因子水平低下而导致的出血症治疗。我国是乙型肝炎患者大国，再加上其他类肝脏疾病，对PCC制品的需求有较大的患者群体，随着临床认同度的提高，近年来，PCC制品有较大的使用需求。

自20世纪50年代PCC用于临床以来，不断有静脉输注后导致血栓形成的报道，因此，减少潜在致栓性发生的高端PCC制品的开发是该制品的研究重点。高端PCC制品应具有较少的促栓蛋白因子，四种凝血因子II、VII、IX、X应具有较好的纯度及均衡度。目前国内市场成型的PCC制品，凝血因子II、VII、IX、X的比活性大多在0.3-1.0IU/mg之间，纯度相对较低。此外，凝血因子II、VII、IX、X均衡度也有待改善，从某种意义来讲，国内目前PCC制品存在一定的血栓副反应发生的隐患。

凝血因子易失活变性，此类制品为了便于保存、运输，在制备过程中需冷冻干燥处理成为粉针制剂。在冷冻过程中，冰晶从溶液中析出，制品盐离子浓度迅速增加、盐析过程又引起制品内部pH值变化、冷冻过程的表面诱导破坏和低温条件等诸多因素均对蛋白稳定性有负面影响；在干燥过程中，制品溶液玻璃化及玻璃化转变、水分升华氢键的直接暴露等因素也容易引起蛋白质的变性，对于易失活变性蛋白类制品，冷冻干燥过程必须添加一定的稳定剂。

高纯度PCC蛋白含量相对较少，对稳定剂的要求更较高，至今未见有关PCC冷冻干燥稳定剂的报道，更未见精氨酸或/和海藻糖或/和组氨酸或/和甘氨酸用于高纯度PCC冷冻干燥稳定剂的研究报道。

发明内容

要解决的技术问题

为了能有效保护高纯度PCC在冷冻干燥过程中凝血因子蛋白活性，减少凝血因子的活性损失，本发明提供几种和几组高纯度PCC的稳定剂，经冷冻干燥处理能有效地保护凝血因子II、VII、IX、X的活性，其中凝血因子IX活性收率均＞70％。

技术方案

本发明以高纯度PCC为材料，经冷冻干燥、成形外观比较、活性测定、复溶澄清度比较获得3种和6组高纯度PCC冷冻干燥保护剂，具体步骤如下：

a)高纯度PCC制备

以健康人混合血浆去除冷沉淀上清为原料，利用扩张床技术制备高纯度PCC。将收集的洗脱峰溶液用所含0.01M柠檬酸钠、0.5％NaCl、pH7.0超滤缓冲液在Millipore Labscale超滤浓缩系统中超滤、脱盐、浓缩并活性测定，获得高纯度PCC。

上述制备的高纯度PCC组成特征为：

b)冷冻干燥稳定剂的添加

以凝血因子IX为标准，适当调整浓缩液凝血因子活性单位至9-15IU/ml，按比例加入精氨酸或/和海藻糖或/和组氨酸或/和甘氨酸稳定剂，调整pH至7.0-7.2，除菌过滤、分装。

c)冷冻干燥

分装后制品-40℃预冻6hr-9hr，Labconco FreeZone冻干机真空冷冻干燥，按图1冻干曲线进行冷冻干燥。

d)成形外观比较

对冻干后制品成形外观进行比较。

e)活性测定及分析

注射用水溶解冻干制品，一期法测定凝血因子活性，对比分析。

f)复溶澄清度比较

对复溶后冻干制品澄清度进行比较分析。

有益效果

本发明的有益效果是，提供了3种和6组高纯度PCC冷冻干燥稳定剂，对凝血因子II、VII、IX、X有较好的保护作用，其中凝血因子IX的活性收率均在70％以上，最优保护剂组合四种凝血因子活性回收率达84％以上。

具体实施方式