[发明专利]利用无外源培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法

说明书

技术领域

本发明涉及根结线虫的人工繁殖方法，具体涉及一种利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是严重危害作物的一类植物寄生线虫，其寄主相当广泛，据不完全统计，根结线虫寄主已超过3000种植物，在世界范围内由根结线虫引起的作物减产为10-20％，严重的可达75％以上(潘沧桑等，1994；Sasser，1983)。

最常见的4种根结线虫是：南方根结线虫[Meloidogyne incognita(Kofoid &White，1919)Chitwood，1949]、爪哇根结线虫[M.javanica(Treub，1885)Chitwood，1949]、花生根结线虫[M.arenaria(Neal，1889)Chitwood，1949]和北方根结线虫[M.hapla Chitwood，1949]。根结线虫不仅自身造成根系形成根结，影响根系的正常发育，还会加重枯萎病、根腐病等土传性真菌病害和部分细菌病害的发生。

为了有效地控制根结线虫病的发生和危害，需要全面系统研究根结线虫的生物学特性、致病性及其与寄主植物的互作关系和遗传学特性，在此基础上进一步研究各种防治方法，而这些研究都需要大量的、虫态一致的和种群单一的、无外源生物污染的虫源。因此，建立能获得符合上述条件线虫的根结线虫纯化培养和大量繁殖体系，是开展根结线虫各方面研究的重要基础。

根结线虫是一类专性的定居型植物内寄生线虫，主要侵染寄主植物的根和块茎等地下组织，必须在有寄主植物活体组织的情况下才能发育、繁殖和完成生活史，迄今国际上尚未有根结线虫可以在无寄主植物组织的情况下完成生活史的公开报道。因此，根结线虫的培养和繁殖离不开植物组织。

培养繁殖根结线虫的常规方法是在温室栽培的寄主植物根系上接种繁殖根结线虫，最常用的寄主植物是番茄和马铃薯(Vazquez等，1991；Jassen等，1995；吴庆丽等，2006)。另外也有报道利用水培的方法培养繁殖根结线虫(Lambert et al.，1992；Snyder et al.，2006)。但盆栽和水培方法所占空间大、管理难、耗时多、工作量大、所获得虫源不纯。

利用离体植物组织培养根结线虫的方法占用的空间小、节省劳力、不受自然环境条件的影响；而用无外源培养基培养的离体根系进行单异体培养繁殖的根结线虫还避免了外源生物和激素的污染，比较纯净，非常适合进行分子遗传学以及根结线虫与植物互作等方面的研究。这种单异活体培养方法不仅可以得到纯化的大量无菌根结线虫，直接用于接种植物和进行其它各类研究，也可以用于根结线虫种质资源的保藏，同时也为研究根结线虫与寄主植物以及其他根际微生物之间的互作关系提供了新的途径。因此，自上世纪30年代以来，人们一直在探索研究利用离体植物组织大量繁殖根结线虫的方法。

Tyler(1933)报道了根结线虫可以离体培养，Mountain等(1955)报道根结线虫可以在多种植物离体根上繁殖，但所报道的这些方法的繁殖率太低，一直未能在实际研究中应用。

Verdejo等(1988)和Mitkowski等(2002)利用发根农杆菌(Agrobacteriun rhizogenes)诱导植物发根或用含外源激素的培养基培养的离体根来繁殖根结线虫。上述离体培养方法虽可以获得一定量的线虫，但仍存在一定的局限性，如操作复杂、成本高并含有外源生物或激素，试验中会因外源物质的存在而污染培养体系或对试验结果造成干扰。

Hutangura等(1998)和Mitkowski等(2002)分别用无外源生物和无外源激素的培养基培养的番茄离体根和蒲公英离体根成功的单异体培养了根结线虫，但是繁殖量仍很低(分别产生了47个根结和11±3个卵囊)，难以在实际中应用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用无外源生物和激素的培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，该方法包括配制无外源生物和激素的培养基、空心菜离体根系的制备和根结线虫的接种培养等步骤，本发明方法实现了根结线虫的单异体培育保存、快速纯化和大量繁殖等目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用无外源培养基培养的空心菜离体根系单异体繁殖根结线虫的方法，包括以下步骤：

(1)制备空心菜离体根系