[发明专利]一种培养人角膜缘干细胞植片的方法

权利要求书

1.一种以生物羊膜为载体培养人角膜缘干细胞植片的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)组织块贴壁

将修剪后的生物羊膜上皮面向上，平铺于插入式培养皿的聚碳酸酯膜上，将聚碳酸酯膜放入预置灭活3T3成纤维细胞的培养皿中；无菌条件下将修剪后的角膜缘组织直接放置在完整生物羊膜表面；向培养皿中加入1ml培养液；组织块表面加数滴培养液保持湿润；所用的培养液采用DMEM与F-12培养基1∶1混合，加入10％胎牛血清，5μg/ml的胰岛素，20ng/ml的重组人上皮细胞生长因子，50IU/ml的青霉素和链霉素；置于37℃，5％ CO₂-95％空气的培养箱中培养；培养液每2～3天更换一次；每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况；

(2)包含有培养细胞的生物羊膜和去上皮羊膜的苏木素染色

PBS冲洗标本一次，无水乙醇15min，苏木素5min，大量自来水冲洗，晾干、封片；

(3)石蜡组织切片的HE染色

取含培养细胞的组织，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片；二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗；苏木素染色5min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30s，提插数下；自来水冲洗15min；置伊红液2min；常规脱水，透明；中性树脂封片，获得人角膜缘干细胞植片。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的生物羊膜为经钴-60辐照灭菌消毒的冷冻干燥人羊膜。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的生物羊膜修剪为2.5×2.5cm²。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的角膜缘组织修剪为1mm²。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养液采用DMEM与F-12培养基1∶1混合，加入10％胎牛血清，5μg/ml的胰岛素，20ng/ml的重组人上皮细胞生长因子，50IU/ml的青霉素和链霉素。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，步骤为：二甲苯I，5min→二甲苯II，5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，常规脱水，透明，步骤为：95％乙醇I，min→95％乙醇II，1min→100％乙醇I，1min→100％乙醇II，1min→二甲苯石碳酸，3∶1，1min→二甲苯I，1min→二甲苯II，1min。