[发明专利]小分子有机物的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）的量子点标记抗体均相免疫分析技术。

背景技术

环境和农畜产品中农药、药物、环境内分泌干扰物的残留超标，对环境和环境生物构成一定威胁，影响食品安全和人类健康。加强环境和食品安全监控，需要高效快速的分析技术。

目前已报道的农药、药物、环境内分泌干扰物残留的检测方法主要有色谱法和色质联用法。采用这些方法需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才，样品前处理要求高、过程复杂、速度慢，检测成本高，特异性不强，难以适应大量样品和现场快速检测的要求。现有小分子有机物的免疫分析，通常采用聚苯乙烯微孔板作固相载体固定抗体或抗原，在固相和液相界面进行竞争性免疫反应，反应速度慢，需要通过洗涤方式将固、液两相分离。其中酶联免疫吸附分析需要加入酶的底物进行显色反应后检测，步骤较多且时间较长；放射性同位素标记免疫分析方法趋向于淘汰；以有机荧光分子作标记物的荧光免疫分析存在稳定性差、易发生光漂白等问题，与化学发光免疫分析类似，经典的荧光免疫分析容易受背景的干扰。

发明内容

本发明的目的是：以高效水溶性量子点作为纳米荧光探针标记抗目标分析小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）抗体，建立一种特异性强、灵敏度高、简便高效、用于目标分析小分子有机物快速检测的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析新技术。

本发明的原理和技术方案是：以激发波长宽、发射波长窄、荧光量子效率高、稳定性好的水溶性量子点作为纳米荧光探针，采用碳二亚胺法与抗目标分析农药、药物、环境内分泌干扰物抗体共价偶联制备量子点标记抗体；将适量量子点标记抗体用磷酸盐缓冲液稀释成适当浓度，加入含对应目标分析物的标样，与量子点标记抗体发生均相免疫反应，降低了量子点标记抗体的荧光强度（量子点标记抗体发生荧光淬灭），同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；免疫反应平衡后，分别检测空白对照体系的荧光强度F₀和含对应目标分析物体系的荧光强度F，依据空白对照体系的荧光强度F₀与标样体系的荧光强度的比值F₀/F的大小（即量子点标记抗体的荧光淬灭程度）与体系中对应目标分析物浓度在一定范围内成正比的规律，在条件优化的基础上建立免疫分析标准曲线；根据待测样品的F₀/F和所述免疫分析标准曲线，计算待测样品中目标分析物的含量，建立高灵敏度快速检测目标分析小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法。

本发明综合利用免疫分析特异性强、量子点荧光性能优异、均相免疫反应速度快、平衡时间短、可直接进行荧光检测等优势。与常规免疫分析技术相比，本发明所建立的量子点标记抗体非竞争均相免疫分析方法不仅特异性强、灵敏度高、重现性好，而且更加简便高效，不需要进行固液分和显色反应，检测时间约为常规免疫分析的1/4，是对现有小分子有机物免疫分析技术的发展和创新，迄今尚未见同类报道，在环境和食品中农药、药物、环境内分泌干扰物等小分子有机物快速检测方面具有很高的开发应用前景。

附图说明

图1为不同浓度氯氰菊酯与量子点标记抗氯氰菊酯抗体荧光强度变化的关系曲线。

图2为不同浓度氯霉素与量子点标记抗氯霉素抗体荧光强度变化的关系曲线。

图3为不同浓度双酚A与量子点标记抗双酚A抗体荧光强度变化的关系曲线。

具体实施方式

一、量子点标记抗氯氰菊酯抗体非竞争均相免疫分析技术实施例

采用水溶性碳二亚胺（EDC）法（Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008, p495-496），将表面修饰有活性羧基的核壳结构(CdSe/ZnS) 荧光发射波长为625nmd的高效水溶性量子点与对氯氰菊酯具特异性亲和力的抗体共价偶联，制备量子点标记抗氯氰菊酯抗体，经透过分子量为5000的超滤离心管超滤纯化后用含0.5g/L叠氮化钠和1M/L甜菜碱、pH8.3的硼酸盐缓冲液溶解定容至1μmoL/L，4℃保存备用，临用前用0.02mol/L、pH7.2 PBS稀释400倍。