[发明专利]溶藻弧菌HSP70重组DNA核酸疫苗的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，涉及溶藻弧菌HSP70重组DNA核酸疫苗的构建方法。

背景技术：

病原体来源的HSP是一种非常重要的保护性抗原，免疫系统对这些高度保守的分子产生免疫应答。因此，细菌HSP70可以直接作为人工免疫用抗原，也可以和其他抗原多肽偶联或融合构建疫苗。溶藻弧菌是海水养殖动物的常见致病菌。国内尚未见有关溶藻弧菌HSP70引起免疫反应的研究报道,本发明运用PCR技术克隆了溶藻弧菌HSP70基因序列,并将其正确插入到真核表达载体pcDNA3.1中,构建了重组DNA核酸疫苗,为进一步研究该基因的免疫原性及免疫保护性打下了基础。

发明内容：

本发明涉及一种构建溶藻弧菌HSP70重组DNA核酸疫苗的方法，利用其他弧菌已知序列设计引物,PCR扩增HSP70的ORF部分序列，再进行TA克隆和序列测定，然后进行pcDNA3.1重组DNA核酸疫苗的构建并鉴定了构建的成功；其步骤如下：

（1）Primer Premier 5.0软件设计引物：

P1：5'  CCGGAATTCGTAAACCCTGACGAAGC  3'；

P2：5'   CCGCTCGAGCCATCCGCATCAAGGTCAAA  3'；

PCR扩增至溶藻弧菌HSP70 ORF部分序列；反应体系(25 μl)：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/μl)2 μl，Taq酶0.2 μl，引物P1、P2各0.25 μl，DNA template 1 μl，加灭菌三蒸水至总体积25μl；PCR反应参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min；用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，按照Omega公司Agarose Gel DNApurification Kit Ver.2.0介绍的方法回收纯化PCR产物；

（2）回收目的基因片段并与PMD18-T Easy载体以3：1的体积比连接。连接体系: Ligation Mix 5.0 μl，目的片段4.5 μl，PMD18-T Vec-tor 0.5 μl，16℃反应30分钟，需要时放入4℃冰箱保存。连接产物转化感受态E. coli DH5α，碱裂解法少量制备质粒DNA。PCR及EcoRⅠ和XholⅠ双酶切鉴定；反应体系：ddH20 8μL;10×buffer2μL;EcoRⅠ(15U/μL)1μL; XholⅠ1μL;质粒DNA 8μL。37℃水浴2小时。1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。

（3）分别用EcoRⅠ和XholⅠ双酶切真核表达载体pcDNA3.1和TA克隆质粒,均在酶切体系中进行。37℃水浴3小时后凝胶电泳回收。将酶切的质粒用一个柱子回收，如果胶太大无法装入一个离心管，可以分两个管化胶，但是离心时一定要将两管的胶加到一个柱子上。回收时一定要将酒精挥发干净，否则影响连接效率。最后用30～40ul的Elution Buffer溶解，然后取1ul定量。跑完电泳后与MAKER比较以确定1ul中有多少ng的产物。回收后的产物应迅速放入-20℃保存。酶切体系为：40ul质粒加入6ul的10 X H Buffer，4ulECOR1,4ulXhol，再加入6ul的水。

（4）1%琼脂糖凝胶上电泳,利用大质粒提取试剂盒切胶回收酶切后的pcDNA3.1片段和HSP70片段, 按照摩尔比1：6的比例建立一个20ul的连接体系，体系中包含2ul的T4Ligase Buffer，2ul T4Ligase，然后是各l ul目的片段和载体，用水补齐20ul，15℃过夜连接。转化DH5α大肠埃希菌，挑单个菌落。

（5）PCR初步筛选阳性克隆,碱裂解法提取质粒,按照上述方法用EcoRⅠ和XholⅠ酶切、测序鉴定，目的DNA片段连接、转化正确，表明pcDNA3.1重组DNA核酸疫苗的构建成功。

应用实例：

以本发明所构建的溶藻弧菌HSP70重组质粒利用阳性脂质体法将其转染至CHO细胞18-48小时后，对抗原蛋白表达情况进行免疫荧光检测，结果溶藻弧菌HSP70重组质粒在寄主细胞中检测到靶抗原的表达。

本发明的优点:该方法为HSP70免疫原性研究及相关融合疫苗的构建提供依据，相对容易，而成熟的DNA核酸疫苗构建方法能够加快和简化发展相关HSP70新疫苗的进展，并可提供广谱的DNA核酸疫苗 。

具体实施方式：