[发明专利]蓝色刺孢霉菌株的发酵方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及诱变选育的蓝色刺孢霉发酵方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。 

【背景技术】

凝乳酶是奶酪生产中最关键性酶，自从被发现以来一直被广泛应用于奶酪制造工业。奶酪因其丰富的营养价值和美味的口感而受到世界人们的广泛喜爱，全球每年大约需要宰杀5000万头小牛来满足凝乳酶的市场需求。近年来随着人们生活水平的提高，奶酪的需求量不断增大，小牛皱胃酶供应短缺。因此，科学家们千方百计地寻找小牛皱胃酶的代用品。 

蓝色刺孢霉是我们从红曲米中分离纯化出的一株产凝乳酶的菌株。但是这株菌产的凝乳酶活力不高，我们以蓝色刺孢霉为出发菌株，应用紫外线和硫酸二乙酯复合因子诱变出发菌株。诱变选育的优良菌种DU10(微生物保藏号是：CGMCC 5423)，以葡萄糖马铃薯培养基为发酵培养基，发酵液凝乳酶酶活在110SU/mL左右波动，但所产酶活仍不够理想。因而要对培养基进行了优化，通过优化选出了最优培养基，仍需对DU10的发酵工艺参数进一步加深，来提高发酵液凝乳酶活性。发酵工艺参数的改进则需联系到培养温度、摇床转速、培养时间和三角瓶装液量等。 

【发明内容】

本发明的目的是提供一种诱变选育后蓝色刺孢霉优良菌株发酵条件优化的方法，提高蓝色刺孢霉凝乳酶活力。主要工艺路线：利用诱变后的蓝色刺孢霉优良菌株DU10(微生物保减号是：CGMCC 5423)，通过改变发酵条件控制其代谢，生产出凝乳酶活力较高的发酵液。 

本技术方案如下 

1)无菌操作注入10mL无菌水到保存的DU10 PDA斜面中，洗下斜面上的孢子，然后振荡使孢子分散，G3玻璃漏斗过滤，血球板计数并调整孢子浓度为10⁷～10⁸个/mL。 

2)接种由斜面制备的10⁷～10⁸个/mL孢子悬浮液，分别变换培养时间、装液量、接种量、培养温度、转速、发酵时间，进行单因素实验，考察每个培养条件对发酵产酶品质的影响。测定发酵液的凝乳酶酶活(MCA)和蛋白水解活性(PA)，发酵液凝乳酶活越高，MCA/PA比值越大，则发酵所产凝乳酶越好。 

3)最优发酵产酶条件的验证 

发酵罐验证：根据实验选择的最优发酵条件，配制4L发酵培养基装入10L发酵罐，最优发酵条件培养后测发酵液凝乳酶酶活。 

上述步骤2)中发酵培养基的优选配方如下，均为百分含量： 

葡萄糖3.3～3.8％，蛋白胨0.38～0.42％，酵母膏0.58～0.62％，CaCl₂ 0.05％，MnSO₄ 0.25％，吐温-800.1％，蒸馏水补足1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。 

上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。 

上述步骤2)中凝乳酶活力的测定方法为：用0.01mol/L的CaCl₂配制100g/L的脱脂乳，放置40min使所形成的牛乳体系趋于稳定，然后取5mL脱脂乳于试管中36℃保温5min。发酵液5000r/min离心10min使菌丝沉淀，取其上清液0.5mL加入保温的脱脂乳中，漩涡混合器上迅速混合均匀并开始计时，当试管壁上有凝结小块，准确记录发酵上清液使牛乳凝固的时间。定义40min凝固100g/L的脱脂乳1mL所需的凝乳酶量为一个索氏单位(Soxhelt unit，SU)。 

凝乳酶活公式为：SU=2400×5×DT×0.5]]>

式中：T-凝乳时间/s；D-稀释倍数。 

上述步骤2)蛋白水解活性的测定采用Folin试剂法，用10mL0.1NNaOH溶解酪蛋白，pH6.2磷缓冲液定容至100mL。发酵液36℃保温，660nm处比色测酶活力。定义36℃、pH6.2每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个蛋白酶活力单位(U)。 

蛋白水解活性公式为： 

式中：A-蛋白酶活测定时OD值在标准曲线上对应的酪氨酸含量μg/mL。