[发明专利]用于检测人类JAK2基因突变的探针、引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及JAK2基因驱动突变的检测试剂盒。

背景技术

JAK2基因属于JAK基因家族，编码JAK一种酪氨酸蛋白激酶，属于非受体型酪氨酸蛋白激酶。JAK2蛋白激酶与JAKs家族具有相同结构功能区，其结构由4部分组成，分别为C端激酶区、假激酶区、假SH2区和N端FERM区。JAK2蛋白酪氨酸激酶激活的信号通路是细胞分化的主要细胞因子信号传导通路之一。受体信号转导起始于JAK2，通过活化JAK2，进一步活化其下游的STAT蛋白，活化的STAT将信号直接导入细胞核内，调节基因表达，从而参与包括造血和免疫系统在内的多条信号通路。JAK2可以介导多种细胞因子和生长因子信号转导，包括红细胞生成素(EPO)，白细胞介素(IL-3)、生长因子(GH)、血小板生成素(TPO)，粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，从而调节细胞生长、增值和分化。JAK2激酶的持续活化，会激活JAK介导的下游STAT的持续活化，其持续活化可诱发包括骨髓增殖性肿瘤在内的多种肿瘤。

骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasms，MPN)是骨髓里一种血细胞恶变导致的肿瘤，主要包括真性红细胞增多症(Polycythemia vera，PV)、原发性血小板增生多症(Essential thrombocythemia，ET)、特发性骨髓纤维化(Idiopathic myelofibrosis，IMF)、慢性骨髓细胞性白血病(Chronic myelogenous，CML)。研究发现，骨髓增殖性肿瘤发生通常伴有JAK2基因第1849位突变，导致第617位的缬氨酸(V)变为苯丙氨酸(F)。JAK2 V617F突变率在PV患者中约有90％(Lippert，Boissinot et al.Blood 108(6)：1865-1867.2006)，在ET和IMF的突变率为50-60％(Sazawal，Bajaj et al.Indian J Med Res 132：423-4272010)。JAK2基因V617F突变在MPN的发现，使2008年世界卫生组织(WHO)修订MPN的诊断标准，将JAK2V617F的突变作为MPN主要诊断指标之一。因此，检测JAK2基因V617F突变的对临床MPN患者的诊断和筛查有重要意义。

针对JAK2基因V617F突变靶点设计药物已经成为治疗ET，PV，IMF等疾病的最重要的靶点之一。目前的临床药物TG101348和AZD1480是特异性作用于JAK2激酶开发的一类治疗肿瘤的药物，其可以阻断肿瘤细胞JAK2下游的STAT3信号通路的传导，抑制肿瘤的生长和增值，从而达到治疗肿瘤目的。因此，检测JAK2基因是否存在V617F突变，不但可以帮助临床医生进行MPN的诊断，而且可以为临床医生的科学用药提供参考依据。

目前检测JAK2基因突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；检测操作复杂，效率低，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的病理组织的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。包括JAK2基因在内的驱动性基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点，而且多数驱动性突变的检测为小样本组织。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求，迫切需要开发一种高灵敏度与高特异性的JAK2基因驱动突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对JAK2基因驱动性突变的检测，从而为临床个体化用药方案提供科学参考依据。

针对上述问题，本发明开发一种高灵敏，快速、操作简便的JAK2基因突变检测方法和检测试剂盒。本检测方法设计运用一种新型“双环探针”技术，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构，通过与特异性引物相结合，阻止了非特异性扩增。该检测方法的灵敏度可达到0.1％，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于JAK2基因突变检测的引物和双环探针，通过对其驱动性突变的检测实现骨髓增殖性肿瘤的早期筛查和化疗预后，其特异引物与双环探针包括如下序列：

表1EGFR驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列

本发明另一方面提供一种用于检测JAK2基因驱动突变检测试剂盒，其PCR反应扩增体系如下：