[发明专利]结合乙型肝炎病毒表面抗原的核酸适配子及其序列

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与生物医药领域。本发明涉及利用SELEX技术筛选获得的一种靶向感染乙型肝炎病毒肝细胞的核酸适配子，以及此适配子的核苷酸序列。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的重要原因之一，全球3.5亿慢性HBV感染者中约75％分布在亚洲，而我国又是全球HBV感染人数最多的国家。因此，针对乙型肝炎的防治研究一直是我国医疗卫生科研的重要领域。虽然国内乙肝疫苗的计划免疫大大降低了乙肝的发病率，但是对已经存在的HBV慢性感染仍缺乏长期有效的抗病毒药物，且大多数药物并非特异性作用于肝脏。将药物与肝脏靶向性载体结合，使其选择性靶向到特定的肝细胞，从而使药物更高效地传递到肝脏、更好地发挥药物的治疗作用是极具前景的治疗方案。HBV感染肝细胞后能够在感染细胞表面表达病毒的表面抗原HBsAg，利用HBsAg作为靶子，将治疗药物运送到感染细胞内发挥作用是非常有前景的一种治疗设想。

SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)是20世纪90年代初-发展起来的一种新的组合化学技术。它利用大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选，最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。相对于传统意义上的蛋白质抗体分子，经SELEX筛选得到的寡核苷酸适配子分子更小，免疫原性低，能更快渗入细胞，是极具潜力的预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种RNA适配子，通过特异性结合肝脏中感染乙型肝炎病毒的肝细胞来实现乙肝治疗药物运送的靶向性，可用于慢性乙型肝炎的诊断与治疗。

本发明采用以下技术方案：

体外合成一个长度为97核苷酸的含有25个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用酵母表达的方法体外表达乙型肝炎病毒表面蛋白，以其为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的HBsAg特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了一个与HBsAg亲和力高、特异性强的适配子，命名为S-A22；该RNA  适配子的核苷酸序列为：5’-GUUGAUUGCGUGUCAAUCAUGGCCGUCUAUAAUGAUCGUAAACGACGGGUCAUGUGUAUG UGGGGAUUGGGACCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUAC-3’，能形成茎环结构。该适配子能特异性、高亲和力地结合乙型肝炎病毒表面蛋白或靶向结合至感染乙型肝炎病毒的肝细胞。ELISA实验证实该适配子能特异竞争乙型肝炎病毒表面抗原与抗体的结合。

本发明的有益效果：

(1)获得了一种能够特异高效结合乙型肝炎病毒表面抗原的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。

(2)为进一步筛选以核酸适配子为基础的慢性乙型肝炎诊断和治疗药物奠定了基础。

附图说明

图1：是SELEX筛选乙型肝炎病毒表面抗原特异性结合核酸适配子的流程图。

图2：是筛选获得的核酸适配子的二级结构分析图。

其中图2箭头所指为适配子的随机序列区域，该区域形成了一个特殊的茎环结构。

图3：说明了经过12轮筛选富集的RNA文库能够特异性高亲和力结合乙型肝炎病毒表面抗原的结果图。

其中左图为膜结合实验检测不同轮次文库与HBsAg的结合能力，显示了第12轮文库与HBsAg间结合的高亲和力；右图为第12轮文库与HBsAg结合的凝胶阻滞实验。

图4：竞争ELISA实验显示适配子S-A22能够阻断HBsAg与HBsAb的结合，说明S-A22与HBsAg结合后可能封闭了HBsAg与HBsAb的结合位点。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1H1蛋白特异性结合RNA适配子的SELEX筛选