[发明专利]一种重组型核酸建构物及使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种重组型核酸建构物及使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，尤其关于一种在大肠杆菌生产重组蛋白质的工业化制程中，自培养基快速回收大肠杆菌所释出的蛋白质的方法。 

背景技术

人类基因体计划(Human genome project)的终极目标在于勾画出生命的基本蓝图，以便人类能藉此得以了解生理机能及窥探生命奥妙的所在；另一方面，科学家也可藉此按图索骥以破解人类基因之谜，并运用生物关键技术来解决人类遗传疾病的问题，以及发展促进人类未来福祉等相关生物技术。由于这个堪称为二十一世纪人类最伟大计划的顺利推展，也推动了许多真核和原核生物细胞基因体计划的热潮，可预期的是，未来我们将更了解许多基因的基本功用和追溯出相仿蛋白质家族间的演化历程及相关性，以及更进一步了解蛋白质体之间的相互作用对于一个细胞基本生命运作的意义。尤为重要的是，许多具有特殊功用的蛋白质亦将陆续被发现和被运用来增进人类的福祉，而重组基因技术将在此刻扮演最关键的角色。这项技术影响范围将涉及化学工业、生技医药工业、农牧渔业、能源、环境净化等领域，例如重组基因技术可将我们有兴趣的目标基因(target gene)选殖至一个适当的载体(vector)上，随后将所形成的重组型载体输送至一胜任的宿主细胞(competent host cell)中，由此所形成的重组型宿主细胞可于一适当的培养基与培养条件下进行培养，并于适当时机诱导该目标基因的表现，以大量合成所需的重组型蛋白质，这些重组型蛋白质可包括工农业用酵素、木质纤维素水解酶、治疗性蛋白质(therapeutic proteins)、干扰素(interferons)、间白素(interleukins)、激素(hormones)、生长激素(growth hormones)、抗原性多肽 (antigenic polypeptides)、抗体(antibodies)等各类产品。 

利用细菌细胞如大肠杆菌作为宿主细胞来生产重组蛋白质，目前仍是最具有经济、简单、方便等竞争条件，其原因在于大肠杆菌易于培养且生长速率快， 而所需营养基质较经济、简单，并且容易将培养体积放大，菌株对于酸酵的环境条件变化较不敏感，尤其可于细胞内大量累积生产重组蛋白质。然而大肠杆菌缺乏将蛋白质外泌到细胞外的能力，因此为了纯化于胞内累积生产的重组型蛋白质时，工业传统的方法就必须使用破菌的机械设备，将胞内释放出来。 

藉由大肠杆菌生产重组型蛋白质的工业化下游纯化程序，主要包括(1)菌株离心回收，(2)回收菌株破裂，(3)菌液分离，(4)蛋白质纯化，(5)包装等；传统的制程，使用工业级连续式离心机将发酵后的菌株离心回收，并利用工业级的均质机予以打破，以便将于细胞内生产的蛋白质释出。然而工业级连续式离心机价格昂贵，处理时间冗长，且菌株回收效率有限；此外，工业级的均质机破菌效果相当有限，也耗费时日。 

为了便于回收于大肠杆菌胞内生产的重组型蛋白质，Morita等人采用嗜菌体T4溶菌基因Gpt和嗜菌体T7溶酶素来破裂大肠杆菌(Biotechnol.Prog.，2001，17：573-576)。溶菌基因Gpt是一种已知可作用于细胞膜的蛋白质holin，而嗜菌体T7溶酶素具有可分解细胞壁的功能。Morita等人将Gpt和T7溶酶素基因选殖(clone)在一个载体上，并使用T7基因表现系统，以T7启动子来调控此两个基因的表现。以生产重组型β-glucuronidase(GUS)为例，实验结果显示，当使用1mM isopropyl-β-D-galactoside(IPTG)的诱导剂来强制表现Gpt和T7溶酶素，可有效达到细胞溶菌的效果，并能将重组型GUS释放于胞外。然而，以IPTG为诱导物难以达到工业化使用的目的，其主要原因为(1)IPTG的价格昂贵；(2)IPTG不被细菌代谢，易污染发酵液，而增加发酵产品纯化的困难度；(3)IPTG具有潜在的毒性，不适用于生产医疗用的产品；(4)为了达到均匀诱发细胞群的基因表现，需要使用高饱和剂量的IPTG。此外，T7基因表现是目前大肠杆菌中最强的基因表现系统，用来生产重组蛋白质最为有效。然而，该研究使用T7基因表现系统来控制Gpt和T7溶酶素的表现，此策略将使得目标蛋白无法使用T7基因表现系统来表现所欲生产的标的蛋白质，因此限制目标蛋白的生产效能；另一方面，Morita等人的研究报告中并未明述其标的蛋白质(GUS)释放出胞外的效率，以致难以评估其技术的效能。