[发明专利]利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及一种利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法。

背景技术

在传统的PCR产物克隆中，首先利用限制性内切酶对DNA片段进行消化产生粘性末端或平末端，然后使用DNA连接酶完成连接。这种方法不仅受到插入片段和载体酶切位点的限制，并且在大规模的基因克隆中消耗时间，效率相对较低。

基于T4DNA聚合酶的LIC系统作为一种高效的方法被应用于大规模的基因克隆及载体构建。该方法利用T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性，使载体和克隆片段末端产生5’末端突出的单链粘性末端。该方法在设计PCR扩增引物时需添加特定长度(≥15nt)的与载体末端同源的序列作为重组区段，这段序列要求不含某个特定碱基，通过在反应体系中加入相应缺失的dNTP以使T4DNA聚合酶在遇到重组序列以外的该碱基时终止反应，从而产生具有特定长度的5’末端突出单链。该反应产物在退火条件下而不需要连接酶的作用即可通过5’突出的粘性末端发生较为稳定的配对复性，并借助于宿主大肠杆菌内的DNA修复系统重新环化成新的质粒。该方法的连接原理要求必须使用特定的商业化线性载体或通过PCR的方法扩增获得末端重组区段不含某个特定碱基的线性化载体。另外，如果这段粘性末端在编码区内，就会在重组蛋白的氮端出现多余的肽段，这些都在一定程度上限制了该方法的广泛应用。

其它利用核酸外切酶III进行克隆的方法需要对载体和PCR片段分别消化，然后利用酚/氯仿抽提的方法终止反应并对载体及PCR产物分别纯化，方法操作繁琐，应用性不强，因此未得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用核酸外切酶的3’-5’外切酶活性克隆目的DNA的方法，其是通过向含有线性载体和目的DNA片段的体系中加入具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶，在冰上消化30sec～3min，优选消化30sec，使两者产生具有同源序列的5’末端，然后在70～75℃下使酶失活，最后退火使线性载体和目的DNA片段重组形成带有缺刻的环形质粒，并转化到大肠杆菌中，质粒被修复成完整的质粒，并随宿主基因组进行复制。

前述方法中，目的DNA片段的两端带有与线性载体两端同源的10～35个碱基，优选为15个碱基。

前述方法中，退火温度为(重组区段Tm值-5)℃。

前述方法中，具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶为核酸外切酶III、T4DNA聚合酶、Klenow片段、T7DNA聚合酶等。在用核酸外切酶III进行消化时，所使用的线性化载体一定具有经限制性内切酶消化产生的平端或5’突出末端。

前述方法中，线性载体和目的DNA片段以5∶1～1∶5，优选2∶1的摩尔比混合。

前述方法中，加入的核酸外切酶的酶量为5～15个单位/10μL反应体系，优选10个单位/10μL反应体系。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

首先采用带有15个同源碱基的引物PCR扩增所需目的DNA片段，并用内切酶使载体线性化，所产生的线性化载体两端与目的DNA片段两端的15个碱基同源。吸取150ng PCR产物与线性化载体以2∶1的摩尔比混合，冰上加入1μl的10×缓冲液及1μl稀释后为10个单位的核酸外切酶III。利用核酸外切酶III将制备好的PCR产物及线性化载体在冰上消化30秒到3分钟，从而使载体及片段均产生5’末端突出的单链序列。设置PCR程序为70℃20分钟，42℃10分钟，待PCR仪升温至70℃后，将消化结束的反应体系置于PCR仪中加热，使酶热失活从而终止消化反应。于42℃退火，载体与片段重新环化成不完整的质粒。转化大肠杆菌DH5a后，质粒被修复成完整的质粒，并随宿主基因组进行复制。技术路线如图1所示。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明通过控制冰上消化时间来控制5’末端突出单链的长度，不用考虑在载体末端添加额外的缺失某个特定碱基的重组序列，重组后利用细菌的修复机制重新形成完整质粒。

(二)与常规PCR方法相比，由于在引物两端添加的是载体上的同源序列，这不仅不会影响到PCR效率，反而解决了其它LIC系统编码多余蛋白，受商业化特定载体限制等问题，因此本发明适用于将PCR片段克隆到任何可以通过的酶切或PCR线性化的载体，不需要带有特定接头的商业化载体或通过PCR扩增载体。