[发明专利]抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5‑4ScFv及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于单克隆抗体及其编码基因与应用，特别是涉及抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体G5-4ScFv(文中也简称“G5-4ScFv”)及其编码基因与应用。

背景技术

T细胞可依据表面受体(TCR)的不同表达而分成两类：TCRαβ细胞和TCRγδ细胞。γδT细胞是T淋巴细胞库中一个数量较小的亚群，约占正常人外周血T淋巴细胞总数的1％-5％，但在表皮及粘膜等上皮组织中相对富集。在肿瘤免疫中γδT细胞对肿瘤抗原的识别不具MHC限制性及不需特异的抗原呈递作用，且对多种肿瘤细胞具细胞毒活性，从而具有用于肿瘤过继免疫治疗的潜能。抗体固相化体外扩增是获得γδT细胞的一个重要手段，但是由于目前的抗γδTCR单克隆抗体为鼠源性，会产生人抗鼠抗体反应(HAMA)，因而在临床治疗上受到较大限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体。

本发明所提供的抗人γδTCR单克隆抗体的重组单链抗体，命名为G5-4ScFv，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，G5-4ScFv的重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID No：1由120个氨基酸残基组成，序列表中的SEQ ID No：2由108个氨基酸残基组成。

编码重组单链抗体G5-4ScFv的基因(G5-4ScFv)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：3的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No：4的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No：3由360个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID No：4由324个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述重组单链抗体G5-4ScFv的重链可变区和轻链可变区可通过柔性连接肽连接，所述柔性连接肽的氨基酸残基序列的通式为(Gly₄Ser)n，n为1-5的整数，优选为3，其中n为3时的重组单链抗体G5-4ScFv的氨基酸残基序列如序列表中序列5所示。

序列表中的SEQ ID No：5由249个氨基酸残基组成。

编码上述具有(Gly₄Ser)₃柔性连接肽的重组单链抗体G5-4ScFv的基因的核苷酸序列可如序列表中SEQ ID No：6所示。

序列表中的SEQ ID No：6由750个碱基组成。

含有本发明基因G5-4ScFv的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增G5-4ScFv中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种表达抗人γδTCR单克隆抗体重组单链抗体G5-4ScFv的方法。

本发明所提供的表达重组单链抗体G5-4ScFv的方法，是将编码重组单链抗体的重组基因G5-4ScFv插入表达载体中，再将构建的重组表达载体导入宿主细胞，经表达、纯化得到高活性的重组单链抗体G5-4ScFv。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌具体可为E.coli BL2l(DE3)、E.coli BL2l(DE3，plysS)、E.coliJM109、E.coli HB101或E.coli Topl0等，优选为E.coli BL2l(DE3)。

当所述宿主为大肠杆菌时，用于构建所述重组表达载体的出发载体可为现有的在上述大肠杆菌中表达外源基因的表达载体。

所述重组表达载体具体可为将重组基因G5-4ScFv插入pET-22b(+)的多克隆位点得到的重组表达载体G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)。