[发明专利]60Co-γ辐射法选育小麦高分子量谷蛋白亚基新品系

权利要求书

1.一种⁶⁰Co-γ辐射法选育小麦高分子量谷蛋白亚基新品系，方法如下：

(1)将干燥小麦种子置于⁶⁰Co-γ射线下，剂量率为200Gy能级，辐射10分钟；放置48小时；产生小麦诱变1代M₁；

(2)种植M₁代种子：沟播，沟深15厘米，行距20厘米，株距10厘米；混合收获成熟种子，生产诱变2代M₂种子群体；

(3)种植M₂代种子，沟播，沟深15厘米，行距20厘米，株距10厘米，成熟后单株收获，每株随机取5粒；

(4)半粒法提取M₂代小麦谷蛋白；

(5)M₂蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳；

(6)取谷蛋白亚基突变种子有胚端的半粒种子种植，方法同步骤(2)，成熟后单株收获诱变3代M₃种子，每株随机抽取5粒；

(7)用半粒法提取M₃代小麦谷蛋白；

(8)M₃蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳；

(9)确定小麦高分子量谷蛋白亚基突变新品系：与亲本比对亚基条带的数量和位置，数量不等或上下位置不同的为突变新品系。

2.根据权利要求1所述的⁶⁰Co-γ辐射选育小麦高分子量谷蛋白亚基新品系，其特征在于：步骤(4)半粒法提取小麦M₂谷蛋白和步骤(7)用半粒法提取M₃代小麦谷蛋白的方法为：

(1)配制50％异丙醇：取50ml异丙醇，加50ml蒸馏水，混均；

(2)样品提取液的配制：取0.5克巯基乙醇；pH6.8的0.5M的Tris-Hcl三羟甲基氨基烷-盐酸溶液6.25ml；25ml异丙醇；蒸馏水18.75ml，共50ml，按顺序加入，混均；

(3)样品缓冲液的配制：取0.5克巯基乙醇；pH6.8的0.5M的Tris-Hcl三羟甲基氨基烷-盐酸溶液6.25ml，2克SDS十二烷基硫酸钠，甘油12.5ml，水33.75ml，定容至50ml，称取0.001克溴酚兰加入其中，混均；

(4)取无胚端半粒小麦，破碎，放入1.5ml离心管中；加0.5ml的50％异丙醇，放置于60℃汽浴恒温振荡箱中30分钟，振荡速度每分钟60次，转入离心机中，转速10000转/分，离心1分钟，弃上清液，留沉淀；

(5)在步骤(4)的离心管中加0.5ml的50％异丙醇，置于60℃汽浴恒温振荡箱中30分钟，振荡速度每分钟60次，转入离心机中，转速10000转/分，离心1分钟，弃上清液，留沉淀；

(6)在步骤(5)的离心管中加0.5ml的50％异丙醇，放置于60℃汽浴恒温振荡箱中30分钟，振荡速度每分钟60次，转入离心机中，转速10000转/分，离心1分钟，弃上清液，留沉淀；

(7)在有沉淀的离心管中加0.2ml样品提取液，60℃汽浴恒温振荡箱中60分钟，振荡速度每分钟60次，转入离心机中，转速10000转/分，离心10分钟，留上清，吸120μL；

(8)在上清液中加120μL的样品缓冲液，混匀后制成小麦谷蛋白液；

3.根据权利要求1所述的⁶⁰Co-γ辐射法选育小麦高分子量谷蛋白亚基新品系，其特征在于：步骤(5)M₂蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳和步骤(8)M₃蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳的方法为：

(1)配制电极缓冲液：在1000ml的烧杯中加800ml水，加甘氨酸14.4克，Tris三羟甲基氨基烷3.03克，SDS十二烷基硫酸钠1克，用1M的NaOH氢氧化钠调pH至8.3，定容至1000ml；

(2)配制pH6.8的0.5M的Tris-HcL三羟甲基氨基烷-盐酸溶液：6.05克Tris三羟甲基氨基烷溶于80ml水中，用1M的Hcl盐酸调pH至6.8，定容至100ml；

(3)3M Tris-Hcl三羟甲基氨基烷-盐酸pH8.5溶液的配制：36.395克Tris三羟甲基氨基烷，溶于60ml水中，用1M的Hcl盐酸调pH至8.5，定容至100ml；

(4)10％SDS十二烷基硫酸钠溶液的配制：5克SDS十二烷基硫酸钠，加水定容至50ml；

(5)1.5％过硫酸铵溶液的配制：0.15克过硫酸铵加水定容至10ml，现配现用；

(6)30％Acr-0.8％Bis 30％丙烯酰胺-0.8N，N’-亚甲基双丙烯酰胺溶液的配制：30克丙烯酰铵，溶于小于60ml的水中，然后加0.8克N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，定容至100ml；

(7)浓缩胶的组分和配制方法：

配制方法：按顺序加入以上溶液，混合均匀；

(8)分离胶的组分和配制方法：

配制方法：按顺序加入以上溶液，混合均匀；

(9)凝胶的制备：按分离胶的组分按顺序取样，混和后立即加入电泳槽中，加至70％，在用蒸馏水加满，在日光灯下放置1小时聚合。倒出电泳槽中的水，按浓缩胶的组分按顺序取样，混和后立即加入电泳槽中，加满为止，加样品梳，在日光灯下放置1小时聚合；

(10)拔出梳子，用蒸馏水洗，固定于电泳槽内；点样电泳：辐射后代和亲本的蛋白质液，每槽点样15μl，每板稳流13mA，电压一百伏特，电泳9小时，至溴酚兰出底边，再电泳1小时；

(11)染色：将考马斯亮兰加入乙醇中溶解；用12.5％三氯乙酸+0.05％考马斯亮兰配制染色液，将电泳好的凝胶片放入染色液中，放置8小时；

(12)脱色，拍照：倒掉染色液，加蒸馏水，在脱色摇床上脱色1-2天，用凝胶成像系统对凝胶进行拍照；

(13)辐射后代胶片条带与亲本胶片条带比对，筛选高分子量谷蛋白亚基突变的新品系。