[发明专利]利用RGP-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法

说明书

技术领域

本发明属于属分子生物学技术领域，涉及一种利用RGP-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，中国是当今世界最大的烟草生产国，烟叶总产量和总销量都占世界的50％左右。目前烟草税收已经占到我国财政收入的1/10，在国民经济收入中占有重要的地位。但随着栽培条件的变化，烟草的病虫害危害也日益严重，造成巨大的经济损失。据不完全统计，我国每年烟草病害造成的直接经济损失在7亿元以上，烟草野生资源应用于烟草抗病育种日益受到重视。

在烟草育种过程中，很多野生资源的烟草品种具有特异性的品质，如匍匐烟草（N.repanda）具有抗野火病、黑胫病、白粉病、角斑病、蛙眼病和TMV、PV的特性，黄花烟草（N.rustica）具有抗根黑腐病、野火病、黑胫病、白粉病、角斑病、TMV的特性，林烟草（N.sylvestris）具有抗白粉病、角斑病、根黑腐病、TMV、PVY和TEV的特性，克利夫兰氏烟草（N.clevelandii）具有抗PVY和霜霉病的特性，粉蓝烟草（N.glauca）具有抗野火病、白粉病、线虫病和多种病毒病的特性，波叶烟草（N.undulata）具有抗野火病、角斑病、根黑腐病、TMV、PVY和TEV的特性，古特斯皮氏烟草（N.goodspeedi）具有抗霜霉病、白粉病、赤星病和TMV的特性，花烟草（N.alata）具有抗野火病、白粉病、线虫病和炭疽病的特性，蓝茉莉烟草（N.plumbaginifolia）具有抗黑胫病、霜霉病、白粉病、角斑病和多个根结线虫生理小种的特性。但是这些野生资源的传统鉴别方法中往往因生育期过长，从而影响了烟草育种进程；同样，其中间材料的鉴定也存在类似的问题。目前，虽然研究开发了许多分子生物学方法用于作物的种质资源快速鉴别，如使用AFLP、SSR，但是这些方法在烟草野生资源的种质鉴别中均存在一定的局限性，检测过程中灵敏度和准确性不高。因此，研究开发一种能够快速简便的鉴别烟草种质的方法，以提高检测效率非常必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用RGP-3特异性分子标记快速鉴别11个烟草种质的方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的11个烟草种为K326、红花大金元、林烟草、粉蓝烟草、古特斯皮氏烟草、蓝茉莉烟草、匍匐烟草、黄花烟草、克利夫兰氏烟草、波叶烟草、花烟草，提取这11个烟草种的基因组DNA，以其为模板，设计合成RGP-3引物，进行PCR扩增，以扩增产物经过测序后进行种质鉴别，具体步骤为：

A、基因组DNA获得：分别提取上述烟草种的基因组DNA；

B、引物设计合成：以A步骤获得的基因组DNA为模板，经搜索GenBank数据库，根据林烟草的NsRGP-3序列（D67086），用Primer 5.0 软件，分别设计一对包含编码区在内的特异性引物，即正向引物F-primer具有5′ TGTCAATTTATCTGCACAAATG 3′的碱基序列和反向引物R-primer具有5′ GCACGAAAAGAAGTCTTAATATA 3′的碱基序列，然后完成引物的合成；

C、基因组DNA的RGP-3基因序列PCR扩增：将A步骤提取的烟草基因组DNA作为模板DNA进行PCR扩增，所述的PCR反应体系为30μl，包括无菌水19.3μl、不含有MgCl₂的10×Taq DNA聚合酶缓冲液3.0μl、浓度为25mM的MgCl₂ 2.5μl、浓度为2.5mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP 2.0μl、浓度为5U/μl的 Taq DNA聚合酶 0.2μl、A步骤获得的模板DNA 1.0μl和B步骤获得的浓度为10μM 的F-primer和R-primer各1.0μl；PCR反应条件为在94℃下变性3 分钟后，再进行在94℃下变性1分钟，在55℃下退火40秒，在72℃下延伸2分钟，经过35个循环，随后，在72℃下延伸5分钟，并放置在4℃下保存备用；  

D、特异性DNA片段获得、测序和差异比对：用电泳法对扩增出的特异性DNA片段在紫外观察仪下分别切取后，用QIAquick Gel Extraction Kit快速提取试剂盒回收纯化该DNA片段；将该片段分别用pGEM^?-T-Easy Vector Systems试剂盒进行克隆，通过蓝白斑平板筛选重组克隆菌落，并制备重组克隆质粒DNA，电泳检测其分子量大小，确定特异性DNA片段单拷贝插入的重组质粒后送去测序，将此步骤获得的11个烟草种的RGP-3基因组序列进行差异比对。本发明与现有技术相比：