[发明专利]一种制备转基因猪的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种制备转基因猪的方法，特别涉及脂质体介导的制备转基因猪方法。

背景技术：

转基因技术开始于20世纪80年代，目前，转基因技术主要有显微原核注射法，逆转录病毒感染法，胚胎干细胞介导法，体细胞核移植技术，精子载体法，胞浆内单精子注射法，卵母细胞载体法等。

精子载体法是将精子作为外源基因的载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，并使外源DNA整合到染色体中，从而使外源基因进入子代的基因组中目前，应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现的：体外精子转染法和体内精子转染法体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法，体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法；体内精子转染法又可以分为输精管注射转染法、曲细精管注射转染法、睾丸注射转染法等。1971年，Bracket等首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力，并将外源DNA在受精时携带进入卵母细胞。1992年，Lavitrano等应用此法得到阳性转基因小鼠，并发现成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力，其吸收区域是具有特异性的，该区域位于精子头部的顶体后区(post-acrosomal region)，即靠近精核的区域。沈新明等直接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达载体注射到小鼠的曲精细管内，最后通过与雌鼠交配，成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。袁进等报道向通过向曲精细管内注射外源DNA，然后再结合对曲精细管电击或电穿孔处理，以使外源基因进入睾丸生精细胞然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配，得到的小鼠中有一组的阳性检测率达25％。Shen等则将处理方法更为简化，首先直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧光表达的外源DNA及二甲基亚枫的介质，使DNA能够进入睾丸细胞和生精细胞。一个月后用处理的雄兔与雌兔交配，所产生后代的56％仔兔能高效地表达所导入的外源基因。这一转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法的结果。李碧春等以重组的绿色荧光蛋白基因为标记，首次在家鸡上通过采用公鸡睾丸内转染精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)和体外转染SSCs再移植的方法成功地生产出了转基因鸡，并且在家鸭和家鸡上转染功能基因进行验证，结果均说明该方法无需特殊的仪器要求，即可完成转染外源基因的过程，方法简单，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生产转基因鸡群，该方法的建立在家禽上意义重大，突破了制约家禽转基因生产的瓶颈，解决了家禽转基因难的问题，特别是体外转染移植的成功，不仅解决了家禽转基因难的问题，而且为成体干细胞的应用开辟了更广阔的应用前景。

精子载体法中精子孵育前的预处理通常使精子的受精能力下降，于是许多学者尝试借鉴医学上的辅助生殖技术ICSI使处理精子受精，精子胞质内显微受精技术是借助显微操作仪将一个精子或生精细胞直接注入卵母细胞质内，从而完成受精的过程。它降低了对精子各种指标的要求，使各种在体内外不可能发生正常受精的卵子受精，同时可以避免多精子受精，也为研究异种间受精提供了有效的途径1999年。美国科学家Perry等[44]人首次将ICSI技术应用于动物转基因领域，成功地获得了转基因小鼠随即，研究者们分别在猕猴猪上也进行ICSI转基因的尝试，胚胎转基因阳性率也很高，然而这些实验最终并没有得到出生的转基因动物2006年，Kurom等把精子与携带有人白蛋白(hALB)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA序列片断共孵化，通过ICSI方法生产的胚胎移植后生产出一头含有hALB和GFP基因的转基因小猪Garc′a-Va′zquez等将猪的精子经不同方法处理，发现经冻融处理(frozen-thawing，FT)，不加冷冻保护剂速冻处理(quick freezing without cryoprotectant agents，QF)以及用Triton X-100(TX-100)处理过的精子与新鲜的精子相比，它们结合外源DNA的能力明显增强，但其发育能力降低QF和TX-100处理精子所造成精子细胞膜的损伤与FT造成的损伤更能促进精子与外源DNA地结合实验还发现，用新鲜的精子与用FT和TX-100处理的精子经ICSI发育的胚胎中，EGFP表达的胚胎阳性率相近(分别为37.04±3.52％，43.54±5.41％和29.03±8.29％)，而经QF处理过的精子，EGFP胚胎的阳性率明显提高(80.43±5.91％)。这表明精子的细胞膜在DNA相互作用中起着至关重要的作用，经处理过的精子细胞膜更有利于外源DNA与精子染色体结合，但经QF和TX-100处理，可能严重损伤精子的细胞核，引起DNA破碎，或导致染色体的破损，从而对胚胎将来的发育有害。