[发明专利]一种昆虫基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种昆虫基因检测方法，更具体地涉及一种基于昆虫卵的基因检测方法。

背景技术

昆虫是动物界中无脊椎动物的节肢动物门昆虫纲的动物，是所有生物中种类及数量最多的一群，是世界上最繁盛的动物，至今已发现100多万种。昆虫之所以能够长久兴旺的存在于地球之上，与其基因突变个体的大量存在不无关系。基因突变个体的大量存在给昆虫生存提供机会，但也给农业生产带来麻烦。由于昆虫个体变异迅速，造成农业生产中常用的农药在使用过程中由于抗药性个体的迅速出现，而大大缩短了该种农药的使用寿命。在抗虫植物的推广过程中也存在同样的问题。对昆虫基因突变个体实时监测，有利于延长农药和抗虫植物的使用年限。

现在对昆虫基因突变个体的监测一般通过生物测定和分子检测技术，相对于分子检测，生物测定技术耗时耗力。现如今的分子检测一般通过PCR检测或芯片技术。使用PCR技术首先要提取昆虫的基因组DNA，设计基因检测引物，使用昆虫的基因组DNA作为模板进行PCR反应，对PCR产物进行分析，根据扩增片段的大小或序列测定进行昆虫基因变异情况的判断。基因芯片是指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的DNA探针(片段)有序地固定在载体表面，从而形成贮存有大量信息的DNA芯片。与待测样品DNA作用后，即可在短时间内快速准确地获取样品中的基因突变信息。基因芯片需要专用的仪器设备，价格昂贵，且对技术要求较高。这些技术都需要提取DNA，由于昆虫卵相对较小，DNA含量低，DNA提取十分困难，所以DNA提取过程中一般使用昆虫的幼虫或成虫。而提取DNA的时候要杀死昆虫，造成该品系昆虫无法继续繁殖后代，影响对该品系昆虫的其他方面研究。

因此，有必要提供一种成本低、灵敏度高的用于大规模昆虫基因检测的方法。

发明内容

本发明提供了一种昆虫基因检测方法，其使用昆虫卵作为检测对象，以杂交膜为载体，利用Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA。

本发明所述的昆虫基因检测方法包括以下步骤：

(1)将单个或多个昆虫卵分别破碎于杂交膜上；

(2)使用裂解液处理步骤(1)获得的杂交膜上的破碎的昆虫卵；

(3)将步骤(2)获得的杂交膜在2×SSC溶液中清洗；

(4)将步骤(3)获得的杂交膜烘干以固定DNA；

(5)将步骤(4)获得的杂交膜置于杂交袋中，作标记，将预热的杂交液加入杂交袋中，将杂交袋内的空气排空并将杂交袋密封，然后将密封的杂交袋放入杂交炉中预杂交0.5-4小时；

(6)对步骤(5)获得的杂交膜根据目标探针标记类型进行Southern杂交检测。

上述昆虫基因检测方法中，步骤(1)所述杂交膜可为尼龙膜，所述多个昆虫卵可通过施加机械压力的方式被破碎于所述杂交膜上。

步骤(2)所述的裂解液包括氯化钠100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、EDTA 50mmol/L、SDS 0.5％(w/v)、蛋白酶K 2-4mg/ml，所述裂解液的pH值为7.4。步骤(2)的处理温度可为65℃，处理时间可为0.5-2小时(优选1小时)。

步骤(3)所述2×SSC溶液包括氯化钠0.3mol/L、柠檬酸钠0.03mol/L，所述2×SSC溶液的pH值为7.0。步骤(3)的清洗次数可为2次，每次10分钟，并于清洗时不断摇动杂交膜。

步骤(4)的烘干方式可包括以下方式的任意一种：于烘箱中在120℃下烘30分钟，在80℃下于真空中烘2小时，经254nm紫外光照射2分钟。

步骤(5)所述的杂交液包括6×SSC，5×Denhardt，0.5％(w/v)SDS和100μg/ml的鲑鱼精DNA，所述杂交液加入杂交袋的比例可为8-12mL/100cm²(优选10mL/100cm²)，所述预热温度可为42℃，所述密封的杂交袋在杂交炉内的预杂交温度可为42℃。

步骤(6)所述目标探针用带有标记物的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸标记，步骤(6)包括用酶化学法检测所述Southem杂交的结果。

本发明所述的昆虫基因检测方法成本低、灵敏度高，可用于大规模的昆虫DNA检测。