[发明专利]小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分离克隆、酶活性测定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦叶绿素、类胡萝卜素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶活性体外检测技术。

背景技术

类异戊二烯物质存在于所有生物体中，在植物中含量尤其丰富，是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质。目前，已经发现了3万余种植物类异戊二烯，而且这个数字还在逐年增加。该类物质在生物体中具有各种不同的作用，可作为光合色素(如叶绿素、类胡萝卜素)、生长物质和植物激素(细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)、膜结构的一部分如谷甾醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长(如异戊烯基蛋白，细胞分裂素)。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如作为食物香料、饮料、维生素A、D、E，天然杀虫剂如除虫菊素和橡胶等。

类异戊二烯物质的生物合成主要由甲羟戊酸途径中的一系列酶酶促合成的，法呢基焦磷酸合酶(FPS；EC2.5.1.1/EC2.5.1.10)是该代谢途径中分支点的关键酶，通过类异戊二烯1′-4顺序缩合的方式催化异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，首先形成栊牛儿基焦磷酸(GPP)，然后与另一分子异戊烯焦磷酸缩合形成一个多分支点的、特别重要的中间产物法呢基焦磷酸(FPP)，是控制整个代谢途径的限速酶之一。目前已分别从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、橡胶(Hevea brasiliensis)等40种植物中分离克隆了法呢基焦磷酸合酶基因，在本发明申请之前，还没有公开或发表过关于从小麦(Triticum aestivum)中分离克隆法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数等研究资料信息。

发明内容

针对现有技术中在小麦中法呢基焦磷酸合酶基因相关技术的缺失，本发明的发明人提供了一整套关于小麦特别是品种“济南13”法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术。测得自小麦品种济南13克隆获得的法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的V_max分别为22.7±1.5、73.5±16.9和73.0±10.8μmol/min/mg；K_M值分别为0.84±0.14、1.83±0.79和1.51±0.43μM；Kcat分别为1.67±0.11、5.42±1.25和5.38±0.80S^-1，Kcat/K_M分别为1.99x10⁶、2.96x10⁶和3.56x10⁶M^-1S^-1，由此证明克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。本发明为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

本发明提供的小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的编码区基因序列如SeqID No：1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No：2所示。

上述的小麦品种济南13中的法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS是从小麦品种济南13中克隆获得的，其中小麦品种济南13中该基因cDNA总长为1399bp，翻译起始密码子ATG自49位核苷酸开始，终止密码子TAG位于1111位核苷酸处，在1310位核苷酸处有polyA尾巴。因此，小麦品种济南13TaFPS全长cDNA包括1个48bp的5′非编码区、1065bp编码区和1个257bp的3′非编码区，编码一条包含354aa的多肽，分子量约为42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq ID No：3所示；

本发明的发明人提供了该基因的具体的分离克隆方法及其原核表达及酶活性检测的方法为：

1.小麦叶片RNA的分离提取

根据Trizol试剂盒的说明书进行。获得的RNA保存在DEPC水中备用。