[发明专利]一种利用魔芋粉诱导生产壳聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用魔芋粉生产壳聚糖酶的方法，属于生物工程领域。具体而言是指使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以魔芋粉为诱导物通过液体发酵生产壳聚糖酶的技术。

背景技术

壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的多糖，其水解产物壳寡糖的生物活性功能巨大，广泛应用于医药保健、食品、日化、农业等领域。目前国内外降解壳聚糖制备壳寡糖的方法主要有化学法与生物酶法，由于化学法降解效率与环境污染的限制因素，则主要以生物酶法为主，其中又以专一性酶——壳聚糖酶为主，是理想的大规模制备壳寡糖的主要酶。

壳聚糖酶主要存在于微生物细菌和真菌中，如何使微生物中的壳聚糖酶高产量生产成为研究的主要方向。目前国内外生产微生物壳聚糖酶的方法主要是利用底物或底物类似物使其诱导表达，例如曲霉(Aspergillus sp.Y2K、Aspergillus sp.CJ22-326)，环状芽孢杆菌(B.circulans WL-12)，鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas sp.CJ-5)，微球菌(Microbacterium sp.OU01)，茄病镰刀菌(Fusarium solani)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和链霉菌(Streptomyces sp.no.6)都可用壳聚糖为碳源或诱导物诱导生产壳聚糖酶；多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus fukuinensis D2)以胶链壳聚糖或氨基葡萄糖为底物生产壳聚糖酶；假单胞菌(Pseudomonas sp.TKU015)和氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)以蟹壳甲壳素为诱导物生产壳聚糖酶；蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus S1)和黏质沙雷菌(Serratia marcescensTKU011)以虾和蟹的粉末为诱导物生产壳聚糖酶。以上诱导物或碳源中的壳聚糖、甲壳素和虾蟹粉末在水溶液中溶解度极低，以非均相状态存在，结果影响了微生物的吸收利用及壳聚糖酶的生成；而氨基葡萄糖虽然水溶性较好，但由于其生产成本价格高，在大规模生产壳聚糖酶工业上成为了主要的限制因素。

发明内容

比较以上壳聚糖酶的生产方法，本发明提出了一种利用魔芋粉为诱导物生产壳聚糖酶的新技术。该技术具有原料来源易得、生产成本低廉、诱导物水溶性好，菌体对诱导物利用速率快，在体系中为均相、产酶能力稳定、酶活性高，具有较高的实用价值。该技术很好的丰富与补充了壳聚糖酶的生产途径。

本发明所述生产壳聚糖酶技术方案内容如下：

1.使用的菌种：本发明所使用的菌种是一种枯草芽孢杆菌，该菌株来源于中国典型培养物保藏中心，名称为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HD145，保藏号为CCTCC NO：AB 2010353。

2.种子培养：将CCTCC NO：AB 2010353号菌株，使用LB液体培养基为种子培养基进行培养。培养基经121℃30min灭菌后，挑取一环斜面菌种，于37℃活化培养24h，即得种子液。LB液体培养基的配方为：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，其余为水。

3.以魔芋粉为诱导物生产壳聚糖酶

(1)将37℃活化24h的CCTCC NO：AB 2010353号枯草芽孢杆菌接种于诱导培养基中，诱导培养基的配方由7％～14％60-80目魔芋粉和LB液体培养基组成(w/v)，接种量为2％，诱导温度31℃～37℃，pH为5.5～9.0，在摇床200rpm条件下进行诱导36～54h，测定壳聚糖酶活性。

最佳诱导参数：诱导培养基的配方由12％魔芋粉和LB液体培养基组成(w/v)，接种量为2％，诱导温度34℃，pH为6.5，在摇床200rpm条件下进行诱导42h。

(2)诱导完成后，将培养液于4℃、10,000rpm离心10min，收集上清，得粗酶液。

(3)壳聚糖酶水解壳聚糖实验

取稀释100倍后的100ul壳聚糖酶粗酶液，与浓度2％的胶体壳聚糖底物，于40℃条件下反应30-60min，测定酶活性大小。壳聚糖酶活力单位(U)定义为每分钟释放1ug氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。

本发明与目前所公开的文献相比，具有突出的实质性特点是：