[发明专利]脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与脱氧雪腐镰刀菌烯醇高特异性和高亲和力结合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用。 

(二)背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又称呕吐毒素，是一种B型单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，也污染粮食制品。它对谷物污染率和污染水平居于镰刀菌毒素之首，不仅在赤霉病发展过程中具有重要作用，而且对人畜可以产生广泛的毒性效应，属于剧毒或中等毒物，可致呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，与贫血、免疫抑制、食管癌、克山病也具有密切联系，另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。因此监控DON的含量意义重大。 

DON的检测可用多种不同的方法，如薄层色谱、酶联免疫、气相色谱、液相色谱、近红外光谱分析、荧光极性免疫分析等，其中酶联免疫法(ELISA)以快速、方便、预处理过程简捷占优，但其仍存在一定的问题。ELISA的主要缺点在于DON高效、特异的单抗或多抗制备工艺复杂，所用抗体普遍存在与DON的乙酰化类似物的交叉反应，使其检出值偏高，易出现假阳性；有些检测方法索性用较灵敏的3，5，7-三乙酰化DON免疫产生的抗体替代DON抗体，但这不但要求分析前对提取物进行乙酰化处理，而且检测出的为3一AcDON、15-AcDON和3，15-AcDON混合物的量。可以说，对于DON种毒性小分子，其抗体的制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存等难题，大大限制了酶联免疫吸附法等免疫学检测技术的快速发展。核酸适体(aptamer)是一种比抗体具有更高特异性的配基，甚至能识别单抗所不能区分的靶标分子单个取代基修饰的极细微差别，其作为一种特异性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点，因此，核酸适体在DON这种拥有复杂结构类似物的毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景。 

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与脱氧雪腐镰刀菌烯醇高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体在脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测分析和样品分离富集中的应用方法，具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。 

本发明的技术方案：一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体，其特征在于为核苷酸序列 

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。 

所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的衍生物具有相同功能用途。 

所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。 

所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。 

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的应用，其特征在于将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测分析，它包括以下步骤： 

(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH₂-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用； 

(2)检测步骤： 

①脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体5-10pmol，94℃ 3min、冰上5min变性； 

②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min； 

③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200OliGreen 100μl，作用5min； 

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。 

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。 

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。