[发明专利]一种制备具有抗肿瘤活性鼎湖鳞伞多糖的方法

权利要求书

1.一种生物活性多糖的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)从土豆斜面培养基上取出菌丝体块，接种于种子培养基上，于25℃静止培养12h，摇床转速调为140rpm继续培养96小时。种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1.5，装液量为100mL/250mL。

(2)将步骤(1)制得种子无菌破碎，并进行二级扩大培养。培养基配方同(1)，培养条件为：于25℃，摇床转速为140rpm，培养96小时，装液量为100mL/250mL。

(3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15％(V/V)。发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖36，玉米粉11.8，蛋白胨3，酵母膏5.4，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁1.5；培养条件为：25℃，144小时，摇床转速为140rpm，装液量为100mL/250mL。

(4)过滤得到步骤(3)中菌丝体，用去离子水冲洗菌丝体，55℃烘干，粉碎，过60目筛。

(5)将步骤(4)制得的菌丝体粉中加入去离子水浸提，提取温度90℃，时间2h，提取次数3次，得提取液；

(6)将步骤(5)所得提取液离心分离(离心分离条件：5000rpm，15min)，取上清液；减压浓缩至合适的体积，在浓缩液中加3倍无水乙醇，4℃沉淀过夜，离心取沉淀，离心分离条件：5000rpm，15min；

(7)将步骤(6)所得沉淀物依次用丙酮、乙醚洗涤2次，55℃烘干至恒重，即为鼎湖鳞伞多糖。

(8)将步骤(7)所得多糖用DMEM培养基分别配制成一系列浓度溶液，Methylene Blue法测定其对人乳腺细胞MCF-10A、乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823以及肝癌HepG2细胞体外增殖的抑制能力。

2.制备的鼎湖鳞伞多糖为灰色粉末，其中多糖含量86.95％，容易吸潮。该多糖对人乳腺细胞MCF-10A没有显著的抑制作用，对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖关系。当多糖浓度为62.5μg/mL，作用96h时，最大抑制率为67.5％。同时在52.1μg/mL时，该多糖能显著诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。