[发明专利]一种产2-MIB蓝藻的PCR定性和TaqMan荧光定量PCR定量的检测方法

权利要求书

1.一种产2-MIB蓝藻的PCR定性和TaqMan荧光定量PCR定量的检测方法，其步骤是：

A、采集待测水样，经0.45μm的醋酸纤维素膜过滤，将过滤到的藻进行总基因组DNA的提取和纯化，将提取到的DNA溶于无菌双蒸水中，置-20℃保存；

B、定性PCR的反应体系为：2×PCR反应体系10μl，特异性扩增2-MIB合成相关单萜环化酶基因的正反引物各1μl，待检测的DNA 1μl，以双蒸水校正至20μl体积，所用引物为：CITf5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3，CITr 5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3，以产2-MIB蓝藻DNA为阳性对照，双蒸水为阴性对照；

C、定性PCR的反应程序为：94℃预变性3min，接着40个循环，每个循环94℃30s、58℃30s和72℃30s，循环过后最后72℃延伸5min；

D、定性PCR产物和阳性对照、阴性对照一起进行2％w/w琼脂糖凝胶电泳，电泳过后溴化乙锭染色，紫外灯下观测，目标条带长度为206bp；

E、荧光定量PCR的反应体系：反应体系20μl，含Taqman reaction Mix 10μl，Taqman Probe 0.4μlCtaq：5-CAGCACGACAGCTTCTACACCTCC-3，5端FAM修饰，3端TAMRA修饰，特异性正反向引物各5pmol CRTf：5-CTGTTACGCCACCTTCTYTATGT-3，CRTr：5-ACSGAAAGGAGATCGTTGACC-3，目标产物大小为87bp，待测样品总DNA 1μl，用双蒸水补足反应体系，阴性模板对照加无菌双蒸水；

F、荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性5min，接着40个循环，每个循环包括94℃30s、56℃30s和72℃30s，每个循环完成后进行一次荧光检测，反应完成后记录各个样品的Ct值；

G、标准曲线的制作：取已知浓度的产2-MIB假鱼腥藻做为标准藻株，提取其基因组总DNA，10倍梯度稀释做为标准模板：108-103拷贝/μl，依照上述荧光定量PCR的体系步骤5和步骤6与待测样品同时进行定量PCR扩增，反应结束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧光定量PCR标准曲线；

H、根据待测样品的Ct值和标准曲线计算样品2-MIB基因的拷贝数，进而推算原水样中产2-MIB蓝藻的浓度。