[发明专利]神经干细胞的传代分离方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种传代分离神经干细胞神经球的方法。

背景技术

神经系统疾病的发生和发展是由于神经细胞数量减少或功能改变造成的。通过移植神经前体细胞可治疗相关神经系统疾病，其机制是替代减少和病变的神经细胞、分泌神经保护因子和调节局部免疫学反应。神经前体细胞可通过神经干细胞或胚胎干细胞获得。

神经干细胞是一种多能干细胞，在相关细胞因子刺激下，可在体外增殖并形成特殊的球状结构，此球状结构被称为神经球。神经球具有特殊的微环境，可保持球内干细胞的存活和增殖，并赋予神经干细胞向外胚层细胞(神经元和神经胶质细胞)分化的潜能。神经球的制备是神经干细胞治疗的关键步骤，它们的质量直接影响到神经干细胞治疗的临床疗效。

分离神经干细胞神经球，制备单细胞化方法，是影响高质量神经球制备的关键技术，目前常用的方法包括酶消化法或机械吹打法。酶消化法是利用单独胰酶或胰酶与EDTA合用的方法消化神经球。研究显示酶消化法可导致干细胞发生突变，也存在操作时间长和细胞损伤大等缺点。机械吹打法采用滴管或移液管对组织进行反复吹打，尽管操作时间短，但同样对细胞损伤大。并且所得到的细胞团块大小不均，导致部分神经球体积过大，影响神经干细胞的存活、生长和分化。

因此，建立一种简便、快速、无诱发基因突变、对细胞损伤较小以及可制备大小均匀的神经球的制备方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于，解决神经干细胞传代过程导致的神经干细胞易发生突变、细胞损伤大以及操作时间长和神经球大小不均一等问题，提供一种具有简便、快速、无诱发基因突变、对细胞损伤较小的神经干细胞神经球传代分离方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种神经干细胞的传代分离方法，其步骤如下：

a.将神经干细胞神经球经过离心后，用毛玻璃挤压研磨神经干细胞神经球，再经不锈钢网过滤；

b.将过滤后的细胞稀释到1×10⁷个/mL，置于5％CO₂培养箱中继续培养，连续培养1-2天，得到新生的神经干细胞神经球。

如上所述的方法，优选地，所述毛玻璃片为将玻璃平板通过金刚砂研磨和氢氟酸溶蚀制备而成的毛玻璃片。

如上所述的方法，优选地，所述不锈钢网的目数为80目-200目。

如上所述的方法，优选地，所述毛玻璃片的制备方法为：

a.取2块玻璃板，将其中一块玻璃板平放在容器中，在其上表面均匀涂布金刚砂砂粒；

b.于玻璃板的上表面滴加氢氟酸，使沙粒间充满液体；

c.取另一块玻璃板压在金刚砂粒层上面，用手按压上层玻璃板并作环形研磨；

d.研磨数分钟后，将两块磨好的毛玻璃板用清水冲洗，用玻璃刀分别从两块毛玻璃板的未研磨面切下，将毛玻璃板切割成所述的毛玻璃片。

如上所述的方法，优选地，所述砂粒的粒径大小为0.1～1毫米。

如上所述的方法，优选地，所述毛玻璃片的尺寸为3厘米×10厘米。

本发明的有益效果在于：

采用毛玻璃和不锈钢网联合进行神经干细胞神经球传代分离培养，替代以往的胰酶或机械吹打方法，克服了以往方法所带来的细胞易发生突变以及细胞损伤大、操作时间长等不足。通过本方法的传代分离，获得的子代神经球团块大小均匀，并且研磨后平均可获得2-8个子代神经球。对神经干细胞和前体细胞损伤小，神经干细胞在体外保持旺盛生长传代时间长，没有发生基因突变或贴壁分化现象发生。

附图说明

图1为玻片研磨法获得的神经干细胞的照片，放大4倍。

图2a为玻片研磨法制备的神经球的照片，放大4倍，图2b为移液管吹打法制备的神经球的照片，放大4倍。

图3为玻片研磨法制备的神经球内的神经干细胞标志蛋白nestin免疫荧光检测的照片，放大200倍。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

本发明中所述的含有神经球的细胞培养液，可采用现有技术中常用的方法，例如酶消化法或机械吹打法，由合法取得的流产胎儿或其他胚胎的脑组织中制备并培养得到。

(1)毛玻璃片的制备：