[发明专利]培养肝脏干细胞的方法无效
申请号: | 201110378651.0 | 申请日: | 2011-11-24 |
公开(公告)号: | CN102399744A | 公开(公告)日: | 2012-04-04 |
发明(设计)人: | 毕薇薇 | 申请(专利权)人: | 吉林省拓华生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0735 | 分类号: | C12N5/0735 |
代理公司: | 北京北新智诚知识产权代理有限公司 11100 | 代理人: | 王淳 |
地址: | 136000 吉*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 培养 肝脏 干细胞 方法 | ||
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域,具体来说,是一种提取并扩增肝脏干细胞的方法。
背景技术
以往,肝癌及晚期肝硬化的终末期治疗为肝移植,但供体来源紧缺且移植后不良反应较多。干细胞移植技术应用于临床后,给广大患者带来了生存的希望。最初,临床应用的是自体骨髓干细胞,但骨髓质量受患者年龄,身体状态等条件影响,往往使得干细胞数量及活性减弱。
目前,利用早期(流产)胎儿的组织干细胞治疗相关疾病已进入临床。2003年科学技术部、卫生部印发的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》指出,在知情同意的原则下,允许使用自然或自愿选择流产的胎儿细胞。这为利用流产胎儿的组织细胞进行干细胞培养和研究的合法性提供了依据。
现有技术中,已有利用流产胎儿的肝脏组织培养肝脏干细胞,用于治疗肝硬化及糖尿病的先例,并取得了良好疗效。
现有的肝脏干细胞的培养方法,包括双酶消化法,灌注法,差速离心法,筛网过滤等。
双酶消化法及灌注法,是使用两种酶分阶段消化肝组织、或向肝组织中灌注,使干细胞从组织中分离出来。此种方法处理肝组织的时间长、处理步骤多,易造成污染和对细胞损伤。差速离心法,是不用消化酶而是组织剪碎后通过不同速度剔除组织碎片留下细胞,但这种方法混有的红细胞较多,培养使影响肝脏干细胞的贴壁和生长。
发明内容
本发明的主要目的在于,针对现有技术中培养肝脏干细胞的方法存在处理组织时间长、细胞损伤大及混杂细胞多等不足,提供一种提取时间短、培养质量高的肝脏干细胞的培养方法,以增强肝脏干细胞治疗疾病的疗效。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种培养肝脏干细胞的方法,其步骤如下:
a.在无菌条件下,取经提供者自愿捐献并知情同意、且肝炎病毒标志物、梅毒、HIV检测均为阴性的流产胎儿的肝脏组织,用含有双抗的PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)冲洗3遍;
b.将肝脏组织剪碎,用0.25%g/mL的胰蛋白酶溶液(可以是水溶液或PBS溶液),消化30分钟;
c.用完全培养基中和消化液;
d.将经过步骤b消化和步骤c中和后的肝脏组织在消化液和中和液的混合液体中吹打混匀,以500转/分钟离心5分钟,取上层清液,之后再以1500转/分钟离心5分钟;
e.弃去上层清液,将沉淀用完全培养基悬起,接种于培养瓶中,在37℃下、5%CO2的环境中培养;
f.培养4天后,洗去未贴壁的细胞,用完全培养基进行换液;
g.每隔4天用完全培养基换一次液,待细胞生长扩增达到占培养瓶底面积80%以上,1∶2传代,即由一瓶分装至两瓶,当每瓶细胞又扩增达到占培养瓶底面积80%以上时,再分别传代,以此类推。
其中,所述双抗为在PBS中的终浓度为1%g/mL的青霉素和1%g/mL的链霉素。
其中,所述完全培养基为含10wt%胎牛血清的α-MEM培养基。
其中,在步骤g的传代操作之前,将细胞用胰蛋白酶-EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,乙二胺四乙酸)混合液消化。
所述的胰蛋白酶-EDTA的混合液是由0.25%g/mL的胰蛋白酶和0.02wt%EDTA以1∶1的体积比混合得到的。
本发明的有益效果是:
本发明有益效果在于,应用本发明的技术方案对胚胎肝脏干细胞进行分离培养,细胞活力好,原代组织处理时间及步骤缩短,减少污染机会及对组织细胞的损伤。接种后细胞增殖较快,传代细胞生长较好。经过形态学观察及流式细胞术等检测均符合干细胞特性。本发明方法适用于大量培养用于肝脏疾病的干细胞治疗。显示出本发明的分离培养方法相对于现有技术具有显著的进步。
附图说明
图1为采用本发明方法进行培养的细胞原代培养至第3天的形态学观察照片。
图2为采用本发明方法进行培养的细胞原代培养至第11天的形态学观察照片。
图3为采用本发明方法进行培养的细胞传代培养至第5代的形态学观察照片。
图4为采用本发明方法培养的肝脏干细胞的生长曲线。
图5为采用本发明方法培养的肝脏干细胞表面抗原标志的流式细胞术检测结果。
图6为采用本发明方法培养的肝脏干细胞体外成骨诱导的碱性磷酸酶染色检测结果。
具体实施方式
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