[发明专利]大泷六线鱼细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞系的构建方法，特别是一种大泷六线鱼细胞系的构建方法。

背景技术

大泷六线鱼Hexagrammos otakii 又称欧式六线鱼，俗名黄鱼，属近海冷温性底层鱼类，在我国黄、渤海以及日本、朝鲜和俄罗斯远东诸海都有分布，其肉味鲜美，肉质细嫩，有“北方石斑”之称。大泷六线鱼适应能力强，耐低温，又有性成熟早和世代交替快的生物学特征，栖息于近海岩礁和岛屿附近，洄游活动范围小，因此是礁湾养殖的理想鱼种。近年来，对大泷六线鱼的市场需求日益增大，野生大泷六线鱼种群数量远远不能满足供应，其海水养殖业有待发展。大泷六线鱼细胞系的建立能满足大泷六线鱼病毒学、病理学、毒理学、免疫学、遗传育种和种质保存等理论研究以及病毒疫苗研制等应用研究的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、易操作的大泷六线鱼细胞系的构建方法，以满足对大泷六线鱼理论研究以及病毒疫苗研制等应用研究的需要。

本发明的大泷六线鱼细胞系的构建方法，包括如下步骤：

⑴、制备细胞培养液

选择DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，使胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5ng/ml, I型胰岛素样生长因子的浓度为40ng/ml，硫酸软骨素的浓度为20ug/ml；

在4℃的环境下存放；

⑵、原代培养

在超净工作台上取大泷六线鱼的组织，用青霉素和链霉素的混合液进行浸泡处理，青霉素的浓度为100IU/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，处理时间为30分钟；再用PBS漂洗后，于少量5%FBS-DMEM/F12(Ph7.2)中剪成0.8～1.2mm³的块状，经上述处理的组织块均匀接种于25cm² 细胞培养瓶中，加入培养液3 ml，在25℃CO₂培养箱中启动原代培养；

⑶、传代培养

待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，加入0.25%的胰蛋白酶溶液1ml，消化1min，细胞変圆后，吸去胰蛋白酶溶液，将之前吸出的旧培养液加回，用吸管吹打培养瓶底，制成细胞悬液；向细胞悬液内补入新的培养液，细胞悬液与培养液的体积比为1:2，然后接种于两个培养瓶内；在25℃CO₂培养箱中培养。待细胞再次长成单层后，仍按照上述方法进行传代。

本发明的大泷六线鱼细胞系的构建方法，其中所述的原代培养步骤还需对块状组织用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化30min。

本发明的大泷六线鱼细胞系的构建方法，工艺步骤简单，操作容易；所构建的大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系(HOF、HOL、HOK)形态均为纤维样，可以连续传代并直接应用于病原特性研究、疫苗研制及功能基因研究，满足了对大泷六线鱼理论研究以及病毒疫苗研制等应用研究的需要；该构建方法也适用于其他鱼类构建鱼鳍、吻端和肾脏的细胞系。

具体实施方式

实施例1：

⑴、制备细胞培养液

选择Hyclone公司的DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，使胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5ng/ml, I型胰岛素样生长因子的浓度为40ng/ml，硫酸软骨素的浓度为20ug/ml；

在4℃的环境下存放；

⑵、原代培养

在超净工作台上取大泷六线鱼的鱼鳍组织，用青霉素和链霉素的混合液进行浸泡处理，青霉素的浓度为100IU/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，处理时间为30分钟；再用PBS漂洗后，于少量5%FBS-DMEM/F12(Ph7.2)中剪成0.8～1.2mm³的块状，再用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶对块状鱼鳍组织联合消化30min；

经上述处理的组织块均匀接种于25cm² 细胞培养瓶中，加入培养液3 ml，在25℃CO₂培养箱中启动原代培养；

⑶、传代培养