[发明专利]利用SRAP标记快速检测青花菜杂交种纯度

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术工程，特别涉及一种利用SRAP分子标记快速检测青花菜杂交种纯度的技术。

背景技术

青花菜(Brassica oleracea var.italica)俗称西兰花、绿菜花等，属十字花科芸薹属甘蓝种，是甘蓝与花椰菜等演变中的一个变种，为一、二年生草本植物，原产于意大利。青花菜柔嫩爽口，风味鲜美，营养丰富，是中西餐配菜的重要原料和营养保健蔬菜，是宾馆、饭店及家庭餐桌上的高档菜肴，也是加工速冻、脱水及保鲜蔬菜出口的重要品种之一。目前世界各国青花菜栽培面积逐年增加，有超过花椰菜的趋势。由于其产品出口创汇价值高，内销市场也日益扩大，近年来，我国青花菜的种植面积不断增加。大量医学与营养学研究表明，青花菜中富含4-甲基亚磺酰丁基硫苷(glucoraphanin，又称葡萄糖莱菔子苷)，适宜条件下，该硫苷经过植物中的黑芥子酶或者人体胃肠内微生物水解后所产生的萝卜硫素(sulforaphane，简称SF，1-异硫氨酸-4-甲磺酰基丁烷)具有极强的抗癌以及抗氧化能力。此外，青花菜中还含有丰富的维生素，矿物质以及蛋白质，越来越受到广大消费者的青睐。

青花菜具有明显的杂种优势，其杂种一代已广泛用于生产，但是在杂交制种过程中，由于隔离不严或亲本自交结实等原因，常混有母本自交系种子或由其它不明来源花粉所造成种子的生物性混杂，而大批量制种时，由于机械混杂等原因，也会造成种子混杂，。因此，杂交种在销售前，必须经过纯度检测。目前，大田形态鉴定法是普遍采用的检测方法，此方法虽然比较直观可靠，但费时、费工，成本也较高，因此建立快速、准确和经济的分子标记鉴定青花菜杂交种纯度的方法具有重要意义。

SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)，即相关序列扩增多态性，是一种基于PCR技术的新型分子标记，该标记通过独特的双引物设计对基因的ORFs(Open reading frames)的特定区域进行扩增，上游引物长17bp，对外显子区域进行特异扩增。下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方面，且已有利用SRAP标记对花生、西瓜等种子纯度鉴定的报道，而应用于青花菜杂交种纯度鉴定尚未见报道。

发明内容

本发明提出一种利用SRAP分子标记快速检测青花菜杂交种纯度的方法。其特征在于：所述的快速检测青花菜杂交种纯度是通过SRAP分子方法实现的，通过PCR体系和程序优化，进行筛选引物，获得在亲本间产生多态性的引物组合，同时利用有效的两对引物组合对青花菜杂交种PCR扩增检测，保证了检测结果的稳定性和准确性。

本发明的有益效果是：用SRAP分子标记检测青花菜杂交种纯度，除了方法操作简单、周期短、不受环境控制，检测结果准确率高，同时建立了一套快速有效的室内种子纯度鉴定体系，为新品种保护和快速推广提供技术支撑。

附图说明

图1.青花菜DNA提取电泳检测图谱

图2.SRAP引物组合ME1/EM10对沪绿5号青花菜种子纯度的检测结果

注：M为marker，1为父本，2为母本，3-24为沪绿5号杂交种样本

图3.SRAP引物组合ME6/EM2对沪绿5号青花菜种子纯度的检测结果

注：M为marker，1为父本，2为母本，3-24为沪绿5号杂交种样本。

具体实施方式

该检测青花菜杂交种纯度方法是通过SRAP分子标记的方法实现。从理论上讲，SRAP标记是基于分子水平上的基因型鉴定，鉴定结果准确、可靠。但SRA P标记的本质是PCR反应，在PCR扩增过程中，应充分考虑PCR反应的条件与假阳性，本专利在优化了PCR扩增体系和程序的基础上筛选出在亲本间产生多态性引物组合，并进行了多次重复，保证试验的稳定性和真实性。并且在鉴定过程中，包括从样品采集、DNA提取到编号对应等均做到准确一致且无交叉污染，以保证试验的准确性和可靠性。

实施例：利用SRAP标记快速检测沪绿五号青花菜杂交种的纯度

1材料与方法

1.1材料

植物材料：青花菜杂交一代品种“沪绿5号”及其父母本由上海市农科院园艺研究所提供。