[发明专利]一种真菌木糖异构酶基因及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种木糖异构酶基因，具体涉及来自真菌Piromyces sp.njau1的木糖异构酶基因及其转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。

背景技术：

将木质素纤维素以产业化方式生产乙醇是既经济又环保的方式。因为来自植物的木质纤维素原料是可以大量获得的可再生资源。但是许多能够发酵生产乙醇的酵母(如酿酒酵母)并不能以木糖作为碳源。因此，需要提供能够利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的酵母。

酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，酿酒酵母就可以代谢木酮糖生成乙醇等产物，木糖就可以作为碳源进行乙醇发酵。如果能够有效地将木糖发酵为乙醇，能使木质纤维素乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25％，纤维乙醇生产成本将会降低20％左右。所以木糖发酵产乙醇已成为决定木质纤维素生产乙醇的经济可行的关键因素之一。

木糖异构化所需的木糖异构酶(D-Xylose isomerase，XI，EC 5.3.1.5)催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，广泛存在于细菌、少部分真菌中。酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，木酮糖进入磷酸戊糖途径，发酵生成乙醇。如果发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，酿酒酵母就能够将木糖异构化成木酮糖，达到可利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的目的。

现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。曾有人分别克隆表达了多种来源的木糖异构酶基因，如Escherichia coli，Bacillus subtilis，Thormotoga species，Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。

发明内容

本发明的目的是从真菌中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。

本发明所要解决的技术问题如下：

从真菌中筛选出一种新的木糖异构酶基因；

提供包含上述木糖异构酶及其基因的重组载体；

提供包含上述木糖异构酶基因的重组菌株；

将所得上述重组菌株应用于转化木糖生成木酮糖，进而生成乙醇。

本发明人筛选到一种天然菌株瘤胃真菌Piromyces sp.njau1，从中获得了一种新的木糖异构酶，命名为XI，并得到了一种编码该酶的木糖异构酶基因xylA，实验证明，该基因具有将木糖转化成木酮糖的功能，适合于在能源、酿酒以及食品工业中使用。

虽然本发明最初是通过筛选到该真菌完成的发明，但本发明的结果是得到了基因序列。他人不依赖这种真菌，只要得知序列就可以获得本发明的木糖异构酶。

所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该xylA基因编码的木糖异构酶XI的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明将上述木糖异构酶基因xylA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到包含木糖异构酶基因xylA的重组质粒。所述表达载体优选为酿酒酵母多拷贝表达载体pYES2，得到重组质粒pYES2-PXI。

作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是质粒pYES2上的Spe I和Xba I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于TPI1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pYES2-PXI。

本发明将上述重组酵母表达质粒pYES2-PXI转化进入宿主细胞，得到可以高效表达上述木糖异构酶的重组菌株。

所述宿主细胞为酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选宿主细胞为酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)，更优选的，是将重组酵母表达质粒转化酿酒酵母细胞CEN.PK 113-5D，得到重组菌株P(详见实施例4)。

本发明还提供了包含上述木糖异构酶基因的重组菌株，优选为重组菌株P。重组菌株P能够高效表达上述木糖异构酶，该酶可用于发酵含有木糖的物质，将木糖转化成木酮糖，进而代谢生成乙醇和其他发酵产物。

本发明还提供了一种所得木糖异构酶的应用，包括以下步骤：

1、用权利要求重组质粒转化宿主细胞，得到重组菌株P(详见实施例4)；