[发明专利]杂交瘤细胞株3D6及利用其制备抗甘草酸单克隆抗体的方法

权利要求书

1.一种杂交瘤细胞株3D6，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2011年10月24日，保藏编号为CGMCC 5422。

2.按照权利要求1所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于该杂交瘤细胞株3D6是由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠，并通过杂交瘤技术获得。

3.按照权利要求2所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述的甘草酸人工完全抗原的获得步骤是：首先将甘草酸溶解在二甲基甲酰胺中，然后依次加入二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下反应24小时后，再与载体蛋白分别在常温下混合，反应6小时，最后将反应液用0.05mol/L PBS缓冲液透析得到甘草酸人工完全抗原。

4.按照权利要求3所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述载体蛋白为血蓝蛋白和卵清白蛋白。

5.按照权利要求3所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述甘草酸用量为10-50mg，二甲基甲酰胺用量为2-5ml；加入二环己基碳二亚胺的量为15-25mg；所述加入N-羟基琥珀酰亚胺的量为2-6g。

6.按照权利要求3所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于上述反应液用0.05mol/L PBS缓冲液透析3-8次，每次2-6小时。

7.按照权利要求2所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠的步骤为：首先将稀释、与等体积福氏完全佐剂乳化后的甘草酸人工完全抗原对BalB/C小鼠进行腹腔及皮下多点免疫，免疫剂量50-200μg，随后在21天、35天和49天分别进行三次加强免疫，佐剂为福氏非完全佐剂，免疫剂量50-100μg，至检测免疫效价达到10000∶1，并且半数抑制小于500ppb时满足融合条件。

8.按照权利要求2所述的杂交瘤细胞株3D6，其特征在于所述通过杂交瘤技术获得的具体步骤为：

1)将BalB/C小鼠的脾脏取出、用不完全培养基清洗、剥去结缔组织后，制备成脾细胞悬液，离心处理后再将细胞沉淀用不完全培养基离心洗涤，然后重新制备成10ml细胞悬液，混匀，备用。

2)将上述制备好的脾细胞与骨髓瘤细胞按照4∶1的数量，及不完全培养基充分混合后离心，弃上清液，

3)在37℃条件下缓慢滴加37℃的50％聚乙二醇，后1min、2min、3min加入完全培养基，搅动离心管使聚乙二醇彻底稀释而失去融合作用，离心，沉淀用HAT选择培养液悬起，混合均匀，最后加入到已加有饲养细胞的96孔培养细胞培养板中，在37℃，5％二氧化碳饱和湿度温箱中培养，

4)待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，取细胞培养上清液用ELISA检测法检测，将ELISA检测为阳性的细胞孔，转移至24孔板中，隔天测定效价仍为阳性，则进行亚克隆，其中抑制效果最好的命名为3D6。

9.一种利用如权利要求1所述的杂交瘤细胞株3D6制备抗甘草酸单克隆抗体的方法，其步骤为：

1)用液体石蜡致敏BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只；

2)一周后，取1-2×10⁶个细胞注射小鼠腹腔；

3)观察小鼠不活跃并且腹部明显肿大时，收集腹水，随后每隔1-2天采集一次，反复采集直到老鼠自然死亡为至；

4)收集到的腹水在4℃下保藏24小时，在2000rpm离心5min后收集的上清液即为抗甘草酸单克隆抗体。

10.按照权利要求9所述的杂交瘤细胞株3D6制备抗甘草酸单克隆抗体的方法，其特征在于所得到的抗甘草酸单克隆抗体采用如下步骤进行纯化：

1)将抗甘草酸单克隆抗体用5000rpm高速冷冻离心机离心10min，取上层清亮腹水，按1∶2的比例加入0.05mol/L pH4.4醋酸稀释，得稀释液；

2)按每毫升稀释液加33μl辛酸的比例，在4℃，搅拌状态下逐滴加入辛酸，10min内加完，4℃静置2小时；

3)在10000rpm离心15分钟，取上清液，在冰浴条件下用氨水调pH至7.4；

4)将上清液用0.05mol/L PBS缓冲液透析5次，每次2小时；

5)取透析处理后溶液，在冰浴下搅拌，缓慢加入等体积饱和硫酸铵，然后在4℃静置2h；

6)在5000rpm下离心15min，取沉淀用0.01mol/L，pH 7.4PBS缓冲液复溶，并在4℃条件下用PBS透析3次，即得纯化后的抗甘草酸单克隆抗体。