[发明专利]动物Torque Teno病毒环介导等温扩增技术快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物TTV试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体是一种用于动物TTV病毒的环介导等温扩增技术（LAMP）检测试剂盒。本发明还应用所述的试剂盒对动物TTV病毒进行等温扩增检测的生物学检测方法。

背景技术

TTV（ Torque Teno virus）病毒是一种无囊膜的单链环状球形DNA病毒，现归类为圆环病毒科（Circoviridae）指环病毒属（Anellovirus），包括两种不同的血清型，即TTV1和TTV2。该病毒最早是1997 年由日本学者Nishizawa等从1例输血后非甲～非庚型肝炎病人血清中分离到的新型肝炎病毒，而以该病人的姓名缩写(TT)而命名。又因TTV与输血传播病毒（transfusion transmitted virus,TTV）巧合，因此许多学者亦将其称为输血传播病毒。我国于1998年6月，由中国军事医学科学院首次分离出中国株TTV。同年，湖南医科大学附二院传染科学者克隆出TTV部分基因序列。TTV在各类人群中感染比例都非常高, 研究报道，在亚洲、非洲和南美洲的正常献血者中感染率为30 %～100 %。除了人可感染TTV以外, 现已经证实TTV感染宿主很广, 包括灵长类动物(黑猩猩、类人猿和猴)、家畜( 猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其它动物(老鼠、树鼩和骆驼)。目前，还没有证实TTV可以引发某种具体的疾病，但许多学者认为TTV可能与人类肝炎和猪多系统衰竭综合征（PWMS）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）等疾病病原存在协同作用。有相关的研究显示：TTV在猪繁殖和呼吸系统综合征、结核、人类肝炎等疾病中阳性检出率相当高。因此，TTV在动物群中传播对人类的生活和健康存在一定的潜在威胁。同时猪肉等肉制食品在人们的日常食用中非常普遍，携带该病毒的肉制品对人的健康存在威胁，因而对该病毒的检测在出入境和食品安全检验中起着重要的作用。

TTV在猪群中的感染呈世界性分布。全世界范围内的感染分布很广泛，但不同国家的感染率却有较大的差异，感染率分布在24%～100%之间。同时，相同国家的不同城市不同猪场TTV的感染率也有很大差异。例如：对我国广东等7省的258份猪血样的检测结果表明：TTV感染率在24.1%～100%之间。相关研究还表明：TTV的不同血清型可发生混合感染。目前的流行病学研究表明TTV在人群中主要经血液及其血液制品传播。研究发现，唾液、粪便、胆汁、精液、乳汁、活组织甚至毛发、皮肤中均能检测到该病毒。且较多文献报道，TTV除经血液途径传播外，还可经母婴途径、性交途径、粪-口途径传播，飞沫及经胃肠道传播。同时，相关的研究也表明，TTV还可通过胎盘和子宫垂直传播。TTV在猪中的传播方式可能有以下几种：①通过口粪途径传播；②注射了被TTV污染的疫苗或者是注射是的交叉感染；③垂直感染。

由于该病毒首先在人群中发现，因此，现有的研究主要针对人的TTV较多。主要的检测方法有普通PCR法、巢式PCR法、荧光定量PCR法、原位杂交、酶联免疫吸附法等。如1997年，日本学者Nishizawa等（1997）根据 N22基因序列首次建立巢式PCR（nested  PCR）用于检测TTV。何忠平等（2003）运用Mullins等在HIV基因变异分型中建立的异源双链泳动分析法（HMA）快速检测TTV基因型。Catherine等（2000）建立了检测TTV的免疫印迹法，随后国内学者（邢培清，2002）以TTV ORF2蛋白为抗原，建立了检测TTV的酶联免疫吸附试验（ELISA）。 血清PCR检测虽为主要检测手段，但其扩增受实验条件、费用高、假阳性率高等因素的限制，不宜广泛推广；而血清学试验仅能反应是否感染，并不能检测病毒含量和分型检测。因此，发明一种可以同时鉴别检测动物Torque Teno virus两种不同血清型的检测方法对研究我国猪群中动物Torque Teno virus感染情况具有重要意义。国内外在病原体的检测方法，利用LAMP方法对多种动物疫病和微生物检测已有很多报告，但在兽医临床诊断方法，尚未见有动物Torque Teno 病毒的LAMP诊断方法。