[发明专利]一种莴苣原生质体的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物原生质体技术工程领域，具体涉及一种莴苣原生质体的提取方法。

背景技术

莴苣(Lactuca sativa L.)为一年或者两年生草本植物,属菊科莴苣属,莴苣可分为茎用和叶用两种类型。茎用莴苣肉质鲜嫩，可生食、凉拌、炒食、干制或腌制；叶用莴苣主要食用叶片或叶球。莴苣含有丰富的胡萝卜素、硫胺素、核黄素以及钙、磷、铜、碘、锰等矿物质营养，碳水化合物的含量较低，而无机盐、维生素则含量较丰富，尤其烟酸的含量颇丰，系胰岛素激活剂，糖尿病患者食之有益；莴苣中钾离子含量为钠盐的27倍，有利于体内水盐平衡，对于高血压、心脏病患者有益，具有降低血压和预防心率紊乱的作用。莴苣叶绿素能滋润皮肤，清洁口腔；莴苣还有增进食欲、刺激消化液分泌、促进胃肠蠕动等功能。莴苣内含有多种重要化学物质，能中和消化过程中所产生的酸，有利于消化器官更好地吸收食物营养。生食莴苣，其Vc不致被破坏，有利于人体健康。莴苣叶的营养成分超过其茎部，被美食家誉为“绿色精灵”。近年来的研究发现，莴苣中的一种芳香烃羟化脂，能够分解食物中的致癌物质亚硝胺，对于肝癌、胃癌癌细胞的形成有一定的预防作用，也可减轻癌症患者放疗或化疗的反应。

莴苣广泛栽培于世界各地，已成为人们喜爱的主要蔬菜。在一定程度上对莴苣进行种质创新，同样适应现代化社会发展的需求。通过原生质体培养能得到由单细胞衍生出来的体细胞克隆，这是植物筛选高产，稳定细胞系的良好途径。因为莴苣的原生质体含有其个体的全部遗传信息，在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的；原生质体能够克服性细胞的不亲和障碍，便于进行远缘体细胞杂交，从而获得远缘杂种；原生质体可直接摄取外缘的DNA、细胞器、病毒、质粒等，是进行遗传转化研究的理想受体，可以获得转基因莴苣；莴苣原生质体培养过程中，会产生一些次生代谢物，在技术成熟的条件下可以分离提取；因此利用原生质体培养途径进行莴苣的种质资源创新不失为一种可行且有效的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种莴苣原生质体的提取方法，该方法由莴苣无菌苗的培养、原生质体的质壁分离、原生质体的酶解以及原生质体的纯化四个步骤完成。该方法以提高莴苣原生质体的活力，简单易于操作，分离材料易于得到，酶解的方法简单，去除细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高，活性强，易于莴苣原生质体的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。另外原生质体的超低温保存对于有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价值。

本发明所述的一种莴苣原生质体的提取方法，按下列步骤进行：

a、取莴苣种子，用自来水流动冲洗40-120 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒10-60s，用0.1%升汞灭菌2-10 min，再用无菌水冲洗4-6次；

b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS，温度20±1℃，光照2500-3000 lx，时间16 h/d，培养时间15-35d；

c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎后浸入原生质体清洗液+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25℃黑暗条件下，处理1-4小时；

d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片置于pH5.4-6.2的酶液中，温度20-28℃，转速40-80rpm，黑暗条件下震荡12-16小时进行酶解；

e、将步骤d中的叶片组织，用300-500目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体，弃去上清液，加入原生质体清洗液+13%甘露醇的清洗液混匀，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液+15-25%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心5-10min,即可得到处于中间部分的莴苣原生质体。

步骤b中的诱导培养基中含有蔗糖25-35g/L和琼脂6-8g/L，pH值为5.8。

步骤d中所述酶液为：将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1-2%，离析酶0.2-0.8%,甘露醇9%-13%，2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）3-7mmol/L，庆大霉素0.1-0.5mg/L,四环素0.1-0.5mg/L,氨苄3-5mg/L混合均匀。

本发明所述方法简单易于操作，分离材料易于得到，方法实用。酶解的方法简单，去除细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高，活性强，易于莴苣原生质体的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。另外原生质体的超低温保存对于有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价值。

附图说明

图1 为本发明酶解和纯化后的莴苣原生质体图。

具体实施方式