[发明专利]一种蜂毒的精制方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种蜂毒的分离纯化方法，具体地说是一种蜂毒的精制方法。

二、背景技术

蜂毒是工蜂腺体分泌出来的一种具有芳香气味的毒液，储存于毒囊中，当工蜂攻击其它物种时由尾部蛰针排出，它是一种复杂的混合物，其化学组成复杂，主要分为多肽，大分子量的酶类，小分子量的胺类等物质，肽类主要包括蜂毒素(约占蜂毒干重的50％)，蜂毒明肽，MCD肽，心脏肽，安度肽，组胺肽等，酶类包括55种以上的酶类物质，其中磷脂酶A₂(简称PLA₂，平均分子量14500)是受蜂蜇之后产生过敏反应的主要物质，胺类包括组织胺、儿茶酚胺等其它活性胺类物质，胺类与受蜂蜇产生疼痛有关。

蜂毒在民间用于医疗保健历史悠久，现代研究证实，蜂毒具有抗炎和镇痛作用，用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎，强直性脊椎炎等风湿性疾病，周围神经炎肌神经痛等疾病有确切的疗效，然而蜂毒中大分子量的酶类物质容易造成过敏，小分子量的胺类物质容易造成疼痛，极大地影响了蜂毒制剂在临床上的推广使用。

CN101088514A公开了一种蜂毒的精制方法，是将粗蜂毒溶于乙醇溶液中去除蜂毒中的蜂胶、蜂蜜等杂质，再采用溶媒萃取方法，得到精制蜂毒。先将粗蜂毒加入95％乙醇制成悬浊液，过滤去除杂质，滤液离心后去除液相，沉淀物加入无水乙醇脱水，再将提出的沉淀物加入水于10±2℃下浸提12-15HR；浸提液用乙醇沉淀，去除乙醇水溶液，沉淀物加入0.15-0.2摩尔的氢氧化铵与正丁醇溶液中萃取，弃除沉淀物，蒸馏萃取液，浓缩物进行冷冻干燥即得到精制蜂毒。

CN1416827A公开了一种蜂毒的提取方法。该发明所述的方法如下：将活体大胡蜂剪去羽翅置于有密封盖的容器内，加入40％以上浓度的乙醇水溶液或者40℃以上的食用酒，使活体大胡蜂完全浸泡于其中，将容器加盖密封，静置至少3天，取其容器内下部的乳白色液体，过滤。

CN101455287A公开了一种蜂毒肽的分离提纯方法，是将粗蜂毒用水浸洗，滤液用乙醇沉淀，沉淀物用氢氧化铵和正丁醇萃取，萃取液以丙酮沉淀，使沉淀物溶于脲的醋酸盐缓冲液A中，在离子交换柱上作洗脱层析，柱下收集溶血活性最强吸收峰V的层析馏分浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，丙酮沉淀，再溶解、脱盐沉淀处理，沉淀物溶于醋酸盐缓冲液B中，在葡聚糖凝胶G-25柱上以缓冲B液作梯度洗脱，柱下收集吸收峰时层析馏分浓缩、脱盐冷冻干燥即得到电泳级蜂毒肽。

CN1088215A公开了一种快速从粗蜂毒中分离蜂肽的方法，将粗蜂毒溶解在蒸馏水中，使用超滤膜和透析袋对蜂毒进行分离、纯化。

三、发明内容

本发明旨在提供临床注射用的精制蜂毒，所要解决的技术问题是尽可能多地除去蜂毒中的酶和生物胺类。

本精制方法包括蜂毒粗品的制备和蜂毒粗品的纯化，具体步骤如下：

1、溶解：取蜂毒加5-10倍重量的去离子水溶解后高速离心(3000rpm)10-15分钟，倾出上清液，包括棕灰色残渣内的残留物再加去离子水溶解、高速离心后过滤分离，合并水相，备用。高速离心的作用是使油脂状杂质与残渣分离，转移并漂浮在水相的表面。

2、沉淀：向上述水相中加入1-3倍体积的丙酮，于温度≤-8℃条件下静置至沉淀完全(实验表明不少于10小时)，倾出上清液，向沉淀物中再加入丙酮并捣碎，过滤分离，沉淀物挥去丙酮便得到蜂毒粗品。

实验表明，要使以蜂毒素为主的肽类沉淀完全(≥99％)，丙酮与水溶液的体积比要≥1，取1∶1为佳，这样可节省丙酮用量。

3、纯化：用浓度0.08-0.12mol/L醋酸溶液溶解蜂毒粗品，上葡聚糖凝胶G50层析柱，以0.08-0.12mol/L醋酸溶液洗脱，并用UV-3000紫外检测器在280nm波长下进行在线检测，当第三峰出现时开始收集，至第三峰下降到100mV停止收集。向洗脱液中加入活性炭，缓慢搅拌0.5-1小时，过滤分离，滤液冷冻干燥，得精制蜂毒。

实验表明葡聚糖凝胶G50可有效去除大分子量的PLA2和HAase(透明质酸酶，分子量45000)等酶类蛋白质，又可去除小分子量的胺类物质。活性炭的作用不仅是脱色，同时可有效去除内毒素，活性炭的加入量为洗脱液质量的0.02-0.05％。

蜂毒中大分子量物质约占蜂毒干重的16％左右，通过柱色谱分离，大分子量物质含量＜1.5％，蜂毒素含量≥76％(粗品中蜂毒素含量45％左右)，本精制蜂毒可直接加工供临床注射用的冻干制剂。

四、附图说明

图1是柱层析时紫外在线检测图谱。