[发明专利]三倍体高甜苷罗汉果培育技术

说明书

技术领域

本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育获得三倍体高甜苷罗汉果，属现代生物技术领域。 

背景技术

罗汉果果实性凉味甘，有清热润肺、凉血、润肠通便的功效，特别是其中罗汉果甜苷V甜度约为蔗糖的300倍，是肥胖病人、糖尿病病人、高血压病人理想的食品添加剂，它集天然甜味剂与保健品于一体，被国际公认为综合性状最佳的天然甜味剂。罗汉果被认为是一种非常有潜力的甜味植物品种。长期以来，由于罗汉果落后栽培技术，病毒病害严重，品种退化，导致罗汉果资源稀缺。近十年，经过脱毒技术，罗汉果组培繁殖快速发展起来，但发现组培苗果实中籽粒多且大，不含甜苷成分的种子占整果的50%，整果利用率低，果实种子内的油脂使提取液浑浊，增加了提取难度和成本，二倍体罗汉果甜苷的提取仅在1%左右。品种缺陷造成提取得率低的问题很难通过改进提取工艺来得到解决，使得甜苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这一问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。 

采用现代生物技术培育罗汉果苷含量高、果实结籽减少或无籽优良罗汉果品种，对罗汉果产业发展意义重大。通过人工诱导多倍体是现代育种工作的一个重要手段。植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不结籽的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。 

中国专利申请CN101120653B公开了无籽罗汉果及其培育方法, 通过1）取二倍体罗汉果雌、雄株外植体繁育组培苗；2）取组培继代苗，进行染色体加倍的诱导；3）切取经诱导处理后的雌、雄株的不同部位进行分化培养；4）切取分化培养成的新芽茎尖和茎段进行丛生芽培养；5）将培养成的完整植株进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；6）将四倍体植株和二倍体植株按常规技术种植，开花时进行人工授粉杂交，得到杂交种子；7)将杂交种子繁殖成完整植株，进行染色体数目检测；筛选出三倍 体植株，生根培养、炼苗；8)将三倍体植株和二倍体植株种植，开花时用 二倍体雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。 

本发明人通过长期研究发现，上述技术存在获得的四倍体和三倍体的不稳定问题，（能否进一步说明一下其不稳定的表现），并且在其技术流程中经秋水仙素处理，结合丛生芽诱导，获得四倍体的周期长，嵌合率高，重复性差，影响了该项技术的推广应用。本发明采用幼胚获得脱毒组培苗，嫩芽茎尖直接在秋水仙素培养基上诱导染色体加倍，结合流式细胞重复鉴定分析，获得稳定四倍体，进而与二倍体杂交获得稳定三倍体，大大缩短了四倍体诱导周期，使该项技术的生产应用成为可能，本技术将通过大幅提高甜苷含量和整果利用率，迅速解决甜苷价格昂贵的瓶颈问题，促进罗汉果甜苷售价大幅降低和广泛应用于饮料、食品、保健品、药品等行业（取代有副作用的其他甜味剂），经济效益可观。 

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于三倍体高甜苷罗汉果培育的生产技术。 

本发明三倍体高甜苷罗汉果的培育方法，具体步骤如下： 

1、取田间表型好的罗汉果鲜果，在超净台中进行整果消毒：先用75%乙醇消毒5-8分钟，再用20%次氯酸钠消毒15-20分钟，最后无菌水冲洗3-5次。

2、消毒完毕的整果在超净台中破壳，取出罗汉果种籽，于培养皿中剥出种仁，并将种仁放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽。 

3、待芽长至15-20天左右，切取2-3片嫩叶提取DNA，RFLP分析进行雌雄株鉴定。鉴定为雌株（见附图1）的株系切取嫩芽茎尖， 0.2%秋水仙素诱导48-52小时，诱导后于MS培养基上继续培养。 

CTAB法提取罗汉果基因组DNA方法如下： 

A. 1//2、1/3片叶在液氮中研成粉末（或用打样机）；

B. 将样品放入液氮冻过的EP管中，加65℃预热2×CTAB 1ml；

C. 65℃水浴1h；

D. 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，离心10000rpm，10min，取上清；

E.加入等体积异丙醇，-20℃沉淀20-30min；

F.10000rpm离心10min，倒掉上清，70%乙醇，10000rpm，10min，倒掉上清，晾干；

G.加30-50ul dd H₂O水溶解，-20℃保存;

RFLP分析PCR扩增反应体系（20ul）如下：

水           13.2ul