[发明专利]一种软骨干细胞分离培养方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种软骨干细胞分离培养方法。

(二)背景技术

软骨缺损是一类普遍疾病，严重的关节软骨缺损会导致骨关节炎。在我国，骨关节炎发病率3％，并有逐年上升的趋势。然而目前治疗骨关节炎的手段对症治疗效果短暂，长期疗效不确定，而基于组织工程原理的自体软骨细胞移植的疗法也存在种子细胞来源不足和质量有限的缺陷：成体软骨细胞的的供区极其有限；软骨细胞在体外培养过程中扩增能力有限；传代后的细胞老化，发生“去分化”现象，丧失形成软骨能力等。因此难以用少量的成体软骨细胞经体外培养扩增后来获得大量有正常功能的软骨细胞，从而限制了软骨组织工程的临床应用。为了解决种子细胞来源不足的问题，干细胞凭借其自我更新能力和多向分化潜能的特征，为组织工程提供了理想的种子来源，来源于软骨组织的组织特异性干细胞在其中有其先天优势。最近有研究表明，软骨组织中存在具有多能特性的干细胞。将软骨细胞体外低密度种植，有部分细胞表现出成集落特性。经鉴定发现其中有十分之一的细胞具有向脂肪，骨和软骨多向分化的潜能。从胚胎软骨组织中也分离出了具有间质干细胞特性的细胞。只是，在这样的分离过程中，还没有标准的分选流程，并能保证分选效率。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种软骨干细胞分离培养方法。

本发明采用的技术方案是：

一种软骨干细胞分离培养方法，所述方法包括：

(1)取三代以内的软骨细胞，用细胞培养基I培养至软骨细胞长满培养皿；所述细胞培养基I终浓度组成如下：5～20％(w/v，质量体积百分比浓度，某组分浓度1％表示100mL培养液中含有该组分1g，下同)胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，0.5～2mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM(F12与DMEM体积比1∶1的混合液)；

(2)软骨细胞长满后用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0.01～0.05％，EDTA浓度0.01～0.05％，w/v)消化成单细胞悬液，以小于50个细胞/cm²的密度接种至培养板，利用细胞培养基II进行培养10～14天；所述细胞培养基II终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(3)待获得细胞平铺面积占培养板20～30％的细胞量时，更换用细胞培养基III培养；所述细胞培养基III终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(4)待细胞呈现50％以上面积融合率时，用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0.01～0.05％，EDTA浓度0.01～0.05％，w/v)消化成单细胞悬液，以50～100个细胞/cm²的密度，接种至培养板，用细胞培养基III进行培养；传代细胞经细胞鉴定，获得所述软骨干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。后代细胞可正常传代培养，正常传代条件为：利用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，以100～300个细胞/cm²的密度接种培养。

优选的，所述细胞培养基I终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，1mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM。

所述步骤(2)中细胞接种密度优选为3～10个/平方厘米，所述细胞培养基II终浓度组成如下：20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。

所述细胞培养基III终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。

细胞鉴定方法：

(1)利用CD146抗体，进行磁珠分选进行阴性细胞分选，对比上述获得的软骨干细胞，进行比对鉴定。