[发明专利]一种双水相体系富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法

说明书

技术领域

本发明属双水相体系富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法。

背景技术

红三叶也称红车轴草(Trifolium.Pratense.L)，为豆科(Leguminosae)车轴草(Trifolium.L)属多年生草本 植物。原产于小亚西亚及欧洲西南部，是欧洲、美国东部、新西兰等海洋性气候地区的最重要的牧草和饲料之一，我国南北各地均有栽培。岷县于1944年由美国 引进红三叶，已有60余年的种植历史，经多年的驯化、选育，现已成为当地的优势草种。由于岷山红三叶蛋白质含量高、营养丰富，1987年经全国饲料牧草品种审定委员会审定登记并命名为岷山红三叶，并被誉为中国第一草。

研究表明，岷山红三叶是重要的药材，含丰富的异黄酮类物质，因其独特的药用价值，已由牧草型向药用型发展，该草的主要异黄酮成分为：鹰嘴豆芽素A(bionchanin A)和B(formonetin)、芒柄花素(Formononetin)、刺芒柄花苷(Ononin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)、大豆甙元、大豆甙、染料木甙等，其中以鹰嘴豆芽素A和芒柄花素含量最高。

异黄酮的主要作用是调节人体的内分泌，防止妇女更年期综合症，降低血脂，减少冠心病的发生、防止骨质疏松症、抗癌、止痛消肿、保护神经系统、抗感染、延缓衰老等。异黄酮类物质在医学上具有多种用途，是一种很有价值的药物原料，但是其提取工艺报导得还很少，尤其是完整的提取工艺还未见到。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产品的安全性高、生产成本低、适合产业化开发的富集分离红车轴草异黄酮类物质的方法。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

将红车轴草干燥、粉碎、乙醇回流提取、过滤除杂浓缩得红车轴草粗提液的浓缩液，用双水相体系富集分离此浓缩液中的异黄酮类物质，上相液处理后真空干燥得到红车轴草异黄酮类物质；其特征是取上述红车轴草粗提液的浓缩液，按以下比例加入硫酸铵和乙醇：浓缩液体积占浓缩液和乙醇体积之和的70～90％；液体体积(mL)∶硫酸铵质量(g)为100∶15～31；加热至40℃～45℃，混匀，静置1～3h，分为上、下两相，将上相、下相分开，下相降温、结晶，过滤得硫酸铵晶体供循环使用；上相液加无水乙醇沉淀除残存杂质后回收乙醇，上清液浓缩真空干燥即得红车轴草异黄酮类物质。

应用乙醇-硫酸铵双水相富集分离红车轴草异黄酮类化合物，具有明显的优点：

(1)分相迅速

在实验中观察到，采用乙醇-硫酸铵双水相富集分离法，红车轴草粗提液的浓缩液、硫酸铵和乙醇按合适比例加入加热，混匀后，约10分钟左右即可分相(不需要离心分离)，且没有乳化层，缩短了实验周期。

(2)过程集成

乙醇-硫酸铵双水相富集分离既达到了初步纯化的目的，又浓缩了料液。表现为杂质(如亲水性物质糖、蛋白质等)进入下相，异黄酮类物质富集在上相，上相较原始处理液减少，异黄酮浓度和纯度都提高。

(3)降低物耗

本发明方法用乙醇作为双水相的有机溶剂，毒性小，乙醇和硫酸铵容易回收利用，大大降低了原材料的消耗。

(4)用本发明的方法红车轴草异黄酮类物质的回收率高，生产方法简单，易于掌握，不受环境影响；成本低廉，适合产业化生产。

具体实施方式

实施例1

(1)红车轴草异黄酮类物质的提取

红车轴草烘干、粉碎，以料液比1∶9(g/mL)加入Φ(C2H5OH)＝70％乙醇溶液，回流提取4次，每次1.5h，过滤除杂后得到红车轴草粗提液，真空浓缩至原体积的约1/6得浓缩液。

(2)红车轴草异黄酮类物质的双水相富集分离

取红车轴草浓缩液9mL，加入硫酸铵3.1g和乙醇1mL混匀，45℃水浴2h，期间不断振摇，分相后趁热分开上下相，冷却至室温量取上下相体积，分别为3.36mL和8.00mL，相比(上下相体积比，下同)0.420。分别测定(分光光度法，下同)上相液的异黄酮浓度为7380.110mg/L，下相液的异黄酮浓度为259.434mg/L，异黄酮在上下相的分配系数为28.447，总异黄酮的收率达92.28％。将下相降温、结晶，过滤，过滤所得硫酸铵晶体供循环使用。

(3)上相液用无水乙醇纯化、浓缩、干燥得成品