[发明专利]快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制法

权利要求书

1.快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，其特征是：包括上样垫(1)、含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫(2)、包被质控线(3)和检测线(6)的硝酸纤维素膜(5)、吸样垫(4)以及支撑板(7)；所述检测线(6)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，所述质控线(3)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜(5)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，上样垫(4)位于胶体金垫(2)的上表面，硝酸纤维素膜(5)的下表面与支撑板(7)固定相连。

2.如权利要求1所述的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，其特征是包括以下步骤：

A、抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3和TBEA8的制备：

用于包被检测线(6)的抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201080；

用于胶体金垫(2)中金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201081；

制备方法如下：

1)、单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5×10⁶能产生TBEF3或TBEA8的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心；

2)、TBEF3或TBEA8单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法分别纯化腹水中的TBEF3或TBEA8单克隆抗体；

B、制作包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)；然后将包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)粘贴在支撑板(7)上；

所述包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)的制作方法依次进行如下步骤：

1)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将抗ESAT-6单克隆抗体TBEF3配制成浓度为0.45～0.55mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(5)的下表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成检测线(6)；

2)、用0.01mol/L PH7.4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成0.45～0.55mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(5)的上表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成质控线(3)；

3)、将划线后的硝酸纤维素膜(5)于36.5～37.5℃的温度和小于30％的相对湿度的条件下干燥8～10小时；得包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)；

C、制备含有金标记的抗ESAT-6单克隆抗体TBEA8的胶体金垫(2)：

将TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液加入玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，干燥后，得胶体金垫(2)；将胶体金垫(2)粘贴在步骤B得到的硝酸纤维素膜(5)的上表面的左侧；

所述TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液的制备方法如下：

1)、将质量浓度0.01％的HAuCL₄水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL₄水溶液在磁力加热搅拌下加入1.7～1.8ml的质量浓度1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌8～12分钟；得胶体金溶液；

2)、调节胶体金溶液至pH7.0，将抗体TBEA8按0.85～0.95mg抗体TBEA8/100ml胶体金溶液的比例偶联，混匀后为TBEA8的免疫胶体金探针溶液；

3)、将上述TBEA8的免疫胶体金探针溶液离心后弃去上清，以重悬液重悬沉淀物，得TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液；所述重悬液是步骤2)所用胶体金溶液体积的3/8～5/8；

所述重悬液的制备方法如下：在每L 0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液中加入9～11g的BSA、48～52g的蔗糖、0.28～0.32g的PEG20000制备而得；

D、在步骤C所得的胶体金垫(2)的上表面粘贴上样垫(1)；在硝酸纤维素膜(5)的上表面的右侧搭接吸样垫(4)；得快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸。

3.如权利要求2所述的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，其特征是：所述步骤C中：将TBEA8单克隆抗体胶体金探针溶液按1ml溶液铺23～27cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上。