[发明专利]大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

哺乳动物的核糖体是由4种RNA和大约80个不同的蛋白质组成，其中核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关，小亚基核糖体蛋白命名为S1至S31，大亚基核糖体蛋白命名为L1至LA4。RPL23a蛋白是60s核糖体蛋白的组成部分，由rpl23a基因编码。目前，rpl23a基因在人类及部分动植物中的研究有报道，大熊猫的核糖体蛋白亚基S7、S12、S15、S20、S24、S28以及LSM3等基因的克隆与分析也有报道(罗晓燕等，2008；杜玉杰等，2009；郝彦泽等，2009；侯怡铃等，2009；张田等，2009；Hou W R et al.，2009；Zhang et al.，2009)，而大熊猫rpl23a基因及其RPL23a蛋白在国内外尚未见报道。尤其是大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能在国内外更无任何报道。

大熊猫是我国特有珍稀物种，属国家一级保护动物，它具有极高的生态、科研、经济、文化和美学价值。国内外学者从不同角度和领域对大熊猫进行了大量的研究。目前，大熊猫功能基因的研究在国内外已成为研究的热点(汪晓晶等，2002；侯万儒等，2007；Hou W R et al.，2007；Hou Y L et al.，2009；Qiao et al.，2009；Xu et al.，2009；Wan et al.，2009；Tao et al.，2010)。

发明内容

本发明根据人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、野猪(Sus scrofa)、、小家鼠(Mus musculus)4个哺乳动物物种已知的序列设计引物，以大熊猫骨骼肌为材料，运用RT-PCR和PCR技术分别对大熊猫rpl23a基因的表达序列进行了扩增，克隆和测序；对其序列进行比较、分析，并且构建了含有rpl23acDNA的重组表达载体，转化进入E.coliBL21进行超表达；对超表达产物进行纯化获得大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白；用大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白作用于Hep-2细胞，观察其大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞生长抑制效应，旨在揭示大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白的抗癌功能，为抗癌蛋白药物的研发与抗癌机理的研究提供科学基础和资源。

附图说明

图1大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞生长的影响；(1-8：分别为0，7.4，2.96，1.48，0.74，0.37，0.185，0.148μg/mL大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白浓度)；

图2大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白对Hep-2细胞的形态影响；(1-8：分别为0，7.4，2.96，1.48，0.74，0.37，0.185，0.148μg/mL大熊猫核糖体蛋白亚基基因RPL23a重组蛋白浓度)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.1材料和方法

1.1.1材料及试剂

大熊猫骨骼肌组织取自四川卧龙中国保护大熊猫研究中心死亡的大熊猫，为防止RNA降解，所取组织立即冻存于液氮中；人喉癌Hep-2细胞(购于川北医学院生化与分子免疫研究所)。总RNA抽提试剂盒Total Tissue/cell RNA Extractiob Kits购自Waton公司；逆转录试剂盒Reverse Transcription System购自Promega公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；T载体试剂盒(PMD-18T Vector Systems)及限制性内切酶Sma I，Pst I，SeaII，EcoR I和Sal I均购自宝生物(大连)有限公司；Taqplus聚合酶购自上海生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。宿主菌E.coli DH5a由四川省野生动植物保护与利用重点实验室保存。CW0009 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京易莱西诺生物科技有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Mbchem^TM M2031)购自上海美季生物技术有限公司；RPMI1640粉末购于Gibco公司(美国)，胎牛血清购于四季青生物制品公司，双抗(青霉素，链霉素，购于Gibco公司)。