[发明专利]重组KLK14蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白的纯化方法，具体涉及一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法。

背景技术

人组织KLK14是激肽释放酶家族成员之一，其成熟蛋白分子量为25KD，含227个氨基酸，是一种新型的胞外丝氨酸蛋白酶。KLK14由pre-KLK14被剪切形成有活性的成熟蛋白，成熟蛋白具有与胰蛋白酶及糜蛋白酶相似的蛋白降解活性，偏好型剪切底物精氨酸后一位氨基酸残基。有研究经体外实验证明，KLK14可作用于多种底物包括胶原I-IV，酪蛋白，明胶，层粘连蛋白，高分子量激肽原，纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，玻连蛋白以及类胰岛素样生长因子结合蛋白2和3等。KLK14对细胞间基质的降解活性被证明与多种肿瘤的发展过程相关，包括肿瘤生长，侵袭和血管生成。

Felber LM等于2005年在毕赤酵母表达系统中克隆表达了KLK14蛋白，并在2006年由Diamandis等建立了该酶的纯化方法，该方法包括离子交换与亲和层析两步法对培养上清中KLK14蛋白进行纯化。该方法中，浓缩20倍的1L培养上清分批次进入5ml阳离子交换柱，经盐缓冲液梯度洗脱后的KLK14蛋白进行进一步浓缩后与偶联了胰蛋白酶抑制剂的琼脂糖微粒共同孵育，最终由0.1N甘氨酸缓冲液洗脱。该方法中，由于阳离子层析介质的刚性弱，蛋白载量低，导致层析过程中流速不能太快，使样品处理量受到了很大限制，并且过于长时间的纯化过程易使重组蛋白的活性受到损害。

亲和层析法是近年来各类蛋白纯化的主要研究方向。该方法根据生物大分子能够与配体特异、可逆的结合在一起的特性，可以将目的蛋白从复杂的生物样品中分离纯化，具有较强的选择性，纯化步骤简单，效率高。目前，采用亲和层析法对KLK14进行纯化时，多采用胰蛋白酶抑制剂作为亲和介质与重组KLK14蛋白相互作用，然而由于广谱的胰蛋白酶抑制剂与KLK14的相互作用并不具有特异性，致使纯化过程中其它具有类似胰蛋白酶活性的杂蛋白无法与目标蛋白分离，降低了目的蛋白的纯度。此外，非特异性使胰蛋白酶抑制剂与KLK14之间的亲和力不高，导致洗脱过程中重组蛋白的损耗较大，大大降低了纯化效率。因此，寻找一种高特异性，高亲和力与KLK14结合的蛋白是KLK14纯化过程中急需解决的问题。

SPINK6蛋白是复旦大学实验室在研究细小病毒过程中发现的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，并首次在国际上证明其生物学功能(专利申请号：PCT/CN2009/074410)。最新的研究结果表明，SPINK6蛋白作为KLK家族的特异性抑制剂在皮肤角质层组织中发挥重要作用，其对KLK14的抑制作用尤为明显。目前，上述实验室已成功表达纯化高纯度高活性的SPINK6蛋白，在对KLK14的抑制试验中发现，当SPINK6与KLK14蛋白1∶1孵育时，即可基本完全抑制KLK14的活性。结果证明，SPINK6可以高特异性，高亲和力与KLK14蛋白相互作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法。尤其是一种以偶联SPINK6蛋白的琼脂颗粒作为亲和载体，高效特异纯化KLK14蛋白的方法，

具体而言，本发明的一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)制备亲和层析介质

参考GE公司出版的CNBr活化的Sepharose4B的使用说明书，进行亲和层析介质的制备。具体步骤如下：将亲和介质用pH2.0-3.0的HCl溶液进行溶胀、清洗，HCl溶液的用量为亲和介质的50-100倍体积量，然后用亲和介质的10-20倍的体积量的偶联液进行清洗，使亲和层析介质的pH达到8.0-10.0。

所用的偶联液为含有0.2-0.6M NaCl的NaHCO₃溶液(pH8.0-10.0)。

将重组SPINK6蛋白以重量比1∶200-400溶解在偶联液中，然后与上步用偶联液清洗过的亲和介质混合，在室温条件振荡0.5-2小时，或于4℃条件下放置12-36小时，使重组SPINK6蛋白与亲和介质偶联充分；然后用偶联液清洗制得的亲和层析介质，偶联液用量为制得的亲和层析介质体积的5-20倍；再用亲和介质体积1-5倍的0.1-0.5M的Gly缓冲液(pH 8.0)或1-2M乙醇胺溶液浸泡放置2-4小时，用于封闭亲和层析介质中未被结合的活性位点。

重组SPINK6蛋白与亲和层析介质的重量比为1∶20-150；