[发明专利]一种DAHP合酶的异源可溶性表达方法及其重组载体和基因工程菌

权利要求书

1.一种外源基因在大肠杆菌中异源可溶性表达的方法，其特征在于，其包括以下步骤，构建表达重组外源蛋白的表达载体，该重组表达载体与表达分子伴侣GroEL/GroES的载体共同转入大肠杆菌表达菌株中从而获得可溶性表达外源蛋白的大肠杆菌基因表达工程菌，进行共表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白是来自珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的DAHP合酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达分子伴侣GroEL/GroES的载体为pGro7质粒。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达重组外源蛋白的表达载体是质粒pET28a。

5.一种重组表达载体，其特征在于，其含有来自珍贵橙色束丝放线菌中编码DAHP合酶的aroF基因。

6.一种大肠杆菌基因表达工程菌，其特征在于，其同时包含表达分子伴侣蛋白GroEL/GroES的载体和如权利要求5所述的重组表达载体。

7.一种制备重组珍贵橙色束丝放线菌DAHP合酶的方法，其特征在于，其包括以下步骤：培养权利要求6所述的大肠杆菌基因表达工程菌，从培养物中获得重组珍贵橙色束丝放线菌的DAHP合酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培养方法包括将权利要求6所述的大肠杆菌基因表达工程菌培养至OD600达0.4-0.6，加入IPTG诱导表达。

9.一种如权利要求6所述的大肠杆菌基因表达工程菌表达的重组DAHP合酶的纯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)将如权利要求6所述的大肠杆菌基因表达工程菌菌体，用PBS缓冲液洗涤，加入结合缓冲液，超声破碎，破碎条件为每15ml超声99次，超2s，停9s，功率为200W；

2)步骤1)所得超声破碎后的菌体在12000rpm，4℃条件下离心25min，取其上清加入终浓度为10mM的咪唑；

3)将步骤2)所得混合液上样，先用含20mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤，最终用含200mM咪唑的洗脱缓冲液收集洗脱的目的蛋白，收集的洗脱液用超滤离心管进行超滤离心浓缩。

10.一种DAHP合酶酶活性的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)准备75μl的反应体系，其包括7.5μl 5mM的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和1.5μl 1.5mM的4-磷酸赤藓糖(E4P)，DAHP合酶酶液，并加入终浓度为100mM的MnSO₄，其余为Tris-HCl(pH 7.5)补齐；

2)将步骤1)所准备的反应体系置于30℃条件下反应10min，加入100μl的40％(wt/vol)三氯乙酸终止酶反应，之后加入25μl的100mM高碘酸钾到混合液中，在37℃下反应30min；

3)向步骤2)所得混合液中加入25μl 8％(wt/vol)的Na₂SO₃以消除多余的氧化剂并加入175μl 2.16％(wt/vol)的硫代巴比妥酸后，金属浴100℃条件下煮沸10min；

4)将步骤3)所得混合液加入管子冷却至室温，离心后取上清200μl置于微量比色皿，在UV-1800分光光度计中读取在549nm处的光吸收值。