[发明专利]甘蔗细胞壁结合转化酶基因及其编码蛋白序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗细胞壁结合转化酶(SoCWI)基因及其编码蛋白序列。 

背景技术

细胞壁结合转化酶(Cell Wall Invertase)(以下简称CWI)是高等植物体内控制蔗糖卸载的关键酶，不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖。通过在源与库之间形成蔗糖梯度，调节蔗糖从韧皮部卸出，并且控制蔗糖吸收速度，主要参与韧皮部蔗糖的卸载和库器官的建立，在光合产物的运输上起着重要作用。同时与单糖转运蛋白互作控制细胞分裂和生长，调节植物生长发育和器官建成；作为一个PR(pathogenesis-related)蛋白，参与病原防治；与植物抗衰老、花粉粒的发育有关。 

自1990年Sturm首先从胡萝卜中分离出了CWI基因，随后在马铃薯、拟南芥、烟草、番茄、葡萄、玉米、水稻等植物中也分离到编码该酶的全长或部分的核苷酸序列。在水稻颖果发育过程中，CWI基因表达增强，可以促进胞外蔗糖水解，从而有利于籽粒灌浆。以质外体卸载为主的贮藏器官中，库强主要决定于CWI。玉米MnI编码胚胎特异表达的CWI同工酶，对玉米天然MnI基因缺失的突变体，其籽粒大小只有正常的1/5，说明CWI活性与库强大小密切相关。胡桃CWI在果皮发育过程中有表达，说明果皮发育和韧皮部卸载通路相关。这种机制有利于长距离的吸收运输，为维持异养生长提供基础物质，并且产生出多种参与原初代谢和防卫反应的代谢信号。 

对水稻灌浆过程研究发现，在开花后1-4天CWI活性最高，而这一期间内颖壳长度的增长也是最快的。原位杂交结果表明，CWI主要在背脉维管束的薄壁细胞、珠被及其周围细胞表达，在珠心突起和珠心表皮也有微弱表达。这些结果表明在颖壳发育早期，CWI对子代组织的发育有着十分重要的意义，通过卸载质外体的蔗糖为子代组织提供碳源。而在CWI活性降低的转基因胡萝卜中，表型的改变发生在发育的早期，转化酶可能通过控制糖分的组成和代谢流向而影响早期的发育。当把CWI反义基因导入番茄，大多数植物育性降低。在研究时发现当一种花粉囊特有的细胞壁转化酶同工酶被反义抑制时，植物会产生雄性不育现象，说明胞外蔗糖转化酶为库器官提供碳水化合物。Sherson认为，CWI决定从胞外为细胞提供的是蔗糖还是己糖，胞外己糖的进入可能作为一种信号调控细胞的分裂和分化。在烟草的研究中发现，CWI对于延缓细胞分裂素介导的细胞衰老具有非常重要的作用。同时由于细胞周期的重要调节因子细胞周期蛋白D能够响应碳水化合物信号，因此CWI可能除了满足植物对糖的需 要之外，还调节细胞周期。 

高等植物组织中存在着多种转化酶的同工酶形式。根据最适pH可以分为两大类：酸性转化酶和中性/碱性转化酶；根据其在细胞所处的位置可以分为三类：细胞壁转化酶、液泡转化酶和细胞质转化酶。细胞壁转化酶和液泡转化酶由于最适pH都偏向酸性，因此合在一起归于酸性转化酶类。所有酸性转化酶都是糖基化的，它们不仅可以催化蔗糖的水解，而且可以催化一些寡聚糖(例如棉子糖和水苏糖)的水解。糖基水解酶(glycosyl hydrolase familie)分为四个基因家族：GH32，GH43，GH62，GH68。本发明的甘蔗细胞壁结合转化酶(SoCWI)基因属于GH32家族。甘蔗到目前为止，只克隆出了一个CWI cDNA序列片段(AY302084)，且没有进一步研究的报道。 

发明内容

本发明的目的是：为进一步研究甘蔗细胞壁结合转化酶(SoCWI)基因的功能及应用甘蔗细胞壁结合转化酶(SoCWI)基因改良作物品种，提供一种甘蔗细胞壁结合转化酶基因及其编码蛋白序列。 

本发明所采取的技术方案如下： 

甘蔗细胞壁结合转化酶基因及其编码蛋白序列，是在对所有植物细胞壁结合转化酶基因全长序列进行进化分析的基础上，比对同一家族的细胞壁结核转化酶基因cDNA序列，并设计扩增SoCWI基因核心片段的引物，从甘蔗幼嫩叶片提取总RNA，并经反转录，用常规PCR法扩增SoCWI基因核心片段，然后在核心片段序列5′端设计两个特异引物，在核心片段序列3′端设计两个特异引物和两个锚定引物，通过RACE PCR技术分别扩增到SoCWI基因核心区的5′端和3′端序列；三个序列经过拼接，获得甘蔗细胞壁结合转化酶(SoCWI)基因全长cDNA序列，总长1906bp，经VectorNTI软件分析，该基因的ORF为1734bp，编码577个氨基酸；起始密码子(ATG)位于转录起始位点后62bp处，终止密码子(TAG)后还有一段111bp的非编码序列，并带有真核生物典型的polyA尾巴。