[发明专利]一种L-NCC酰胺水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及来源于假单胞菌的一种L-NCC酰胺水解酶的编码基因，以及重组蛋白质的表达与应用。 

背景技术

N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(N-carbomyl-L-cysteine amidohydrolase)，即L-NCC酰胺水解酶，是一种催化N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine，L-NCC)水解生成L-半胱氨酸的酶。因为ATC消旋酶催化拆分DL-ATC生成L-ATC；L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中C-S单键，生成中间产物L-NCC；再经L-NCC酰胺水解酶催化生成终产物L-半胱氨酸，所以L-NCC酰胺水解酶是参与酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的重要成员之一，具体过程参见附图1。 

L-半胱氨酸(L-cysteine)是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是一种α氨基酸，它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-S-S-)连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L-半胱氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途，日益受到重视。目前L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解后还原法、化学合成法、发酵法和酶法合成法等。近年来，以微生物为酶源，采用酶法制备氨基酸的技术有了快速的发展。微生物酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特别是近年来，以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸，有了显著的进步。目前，有3种微生物酶法转化合成L-半胱氨酸的工艺路线：(1)以3-氯-L-丙氨酸为前体物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以O-乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以DL-ATC为前体物的酶法生产L-半胱氨酸。 

DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。对DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1979年，日本学者Sano提出了完成该转化过程的两种假设：一种是以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine，L-SCC)为中间产物的S-代途径；另一种是以L-NCC为中间产物的N-代途径，反应过程和酶系如附图1所示。其中以L-NCC为中间产物的转化途径最初于1998年由Tamura报道。该学者对L-半胱氨酸合成菌株假单胞菌ON-4a和恶臭假单胞菌AJ3865进行研究，诱导实验发现，如果分别以DL-ATC、L-NCC和L-SCC为诱导物进行细胞培养，诱导后的细胞加入不同的底物进行酶活测定，仅DL-ATC诱导后的细胞具有L-ATC水解酶活性；而且各种细胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而无L-SCC酰胺水解酶活性，而且各种细胞均不能够利用N-氨甲酰-D-半胱氨酸、L-SCC和S-氨甲酰-D-半胱氨酸为底物进行酶促反应生成L-半胱氨酸。Tamura还对中间产物进行了纯化，纯化后的产物经过红外光谱扫描、质谱分析、核磁共振分析和元素分析，结果与标准的L-NCC完全相同，因此证明了这两株菌进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢 途径。 

目前，有关酶法合成L-半胱氨酸相关酶系的报道不多。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新的L-NCC酰胺水解酶及其编码基因，获得活力较高的重组酶，并且这种L-NCC酰胺水解酶可在酶法制备L-半胱氨酸中应用。 

本发明从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101，于2011年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.5315。该菌株进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径，涉及ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶等3个酶的协同催化作用。 

本发明提供的L-NCC酰胺水解酶，来源于假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101，是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代或添加且具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。 

序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列是由420个氨基酸残基组成的蛋白质。 

本发明所提供的L-NCC酰胺水解酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一： 

(1)是序列表SEQ ID No.2的核苷酸序列，由1260个碱基组成； 

(2)编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。