[发明专利]布鲁氏菌检测用杂交瘤细胞株17C8及其产生的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8及其产生的单克隆抗体。

背景技术

布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病。布鲁氏菌能引起哺乳动物的流产、不孕、睾丸炎及关节炎等，同时由于它容易形成气溶胶，具有很高的传染性，所以还被用作生物战剂。

传统的布鲁氏菌检测采用血清学的方法，主要包括玫瑰花环试验、试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、抗人球蛋白试验(COOMB’S)，以及能够标准化的ELISA方法等。血清学方法的不足之处在于它的敏感性较低，而且与霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏、EHEC、沙门氏菌、福氏志贺菌等容易发生交叉反应。因此，制备布鲁氏菌高亲和力的单克隆抗体，且制备的抗体能够识别各个种型的布鲁氏菌，将为布鲁氏菌病诊断方法的研究奠定很好的基础。

发明内容

本发明的目的是提供用于布鲁氏菌检测的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。

本发明所提供的以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株，名称为17C8，细胞株17C8已于2011年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4971。

由杂交瘤细胞株17C8产生的单克隆抗体命名为17C8anti，来源于小鼠属小鼠(Mus musculus)，也属于本发明的保护范围。

17C8 CGMCC No.4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌毒株(如544A、16M、临床株S95(与16M为同种菌)等)以及疫苗株(如S2、S19、M5、104M等)均能够产生特异性免疫反应。

本发明的另外一个目的是提供一种制备上述单克隆抗体的方法。

具体来讲，本发明单克隆抗体的制备方法，可包括以下步骤：

1)用布鲁氏菌全菌抗原作为免疫原免疫动物；

2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；

3)筛选并培养杂交瘤细胞；

4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。

在上述单克隆抗体的制备方法中，步骤1)中的布鲁氏菌全菌抗原可为活菌或灭活菌，优选为活菌抗原，浓度为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL；用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。

步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。

步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。

步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌区分布鲁氏菌毒株和疫苗株的单克隆抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。

本发明还提供了一种检测布鲁氏菌的试剂盒。

本发明所提供的检测布鲁氏菌的试剂盒，包含有杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971产生的单克隆抗体。

本发明提供了以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971及其产生的单克隆抗体。实验证明，杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能够反应，与其它菌株不反应，特异性较高，因而可用于布鲁氏菌的检测中。根据本发明单抗株的特征，可以建立检测布鲁氏菌抗原和血清的方法，应用前景广阔。

生物材料说明：

本发明杂交瘤细胞株，名称为17C8，为单克隆细胞株，该细胞株已于2011年6月16日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4971。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为小鼠三次免疫后的血清抗体效价趋势图

图2为三次亚克隆后挑选细胞上清ELISA检测结果

图3A-图3C为扩大培养各代杂交瘤细胞抗体效价检测结果

具体实施方式