[发明专利]一种免疫亲和层析介质的制备方法及在纯化河豚毒素中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物活性分子的分离纯化领域，涉及一种层析材料，具体说是一种用于河豚毒素分离纯化的免疫亲和层析介质及其应用。

技术背景

河豚毒素(tetrodotoxin，TIX)是一种毒性很强的小分子非蛋白类神经毒素，其可与神经细胞膜的钠离子通道受体高度特异性的结合，从而阻断钠离子通道，抑制神经冲动的传导。因此，河豚毒素具有出色的神经止痛作用，其麻醉效果比一般麻醉药强1000倍以上，而且具有不成瘾的优点，可取代化学药物和中草药用于戒毒。同时，它还具有镇静、抗心律失常、预防肾功能衰竭及降血压等作用，因而具有很大的药用开发价值。虽然河豚毒素具有极强的医疗效果，但其提取工艺极其复杂、纯品的产量极低，目前只有美国、日本﹑中国等少数几个国家有研究和生产的报道，而在国际市场上高纯度的河豚毒素每克价格高达18-20万美金。

目前在制备河豚毒素工艺中涉及到的分离纯化方法主要有：活性炭吸附法、大孔树脂吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等。此类方法如单独使用都存在分离特异性差、回收率不高、产率较低等缺陷。通常是采用多种方法联用的策略，但这同时又会带来分离步骤过于繁琐，目标产物损失过大，消耗大量洗脱试剂等新问题。另有报道利用超滤方法对河豚毒素进行纯化的，但河豚毒素是一个分子量只有319道尔顿的小分子，使用超滤必须使用截留分子量小于500的超滤膜才能起到一定的分离效果，但仍难以将河豚毒素和分子量与之接近的盐类很好的分离，同时超滤法对仪器设备要求极高。目前还有报道利用C₁₈固相萃取小柱来纯化河豚毒素，此方法分离步骤少，但C₁₈固相萃取柱的介质对河豚毒素的分离特异性较低，分离到的河豚毒素达不到标准品纯度，而且C₁₈固相萃取小柱价格高且每次处理量较少。因此，有必要对传统的河豚毒素分离纯化模式和工艺进行创新和改进。

免疫亲和层析（immune affinity chromatography，IAC）是一种利用抗体与抗原之间存在高度特异性的亲和力而发生特异性、可逆性结合的原理，从多组分的混合物中分离特定抗原或抗体的一种层析技术。目前，该方法在抗体、激素、多肽及小分子化合物的分离纯化和分析检测中被广泛应用。虽然免疫亲和技术在上世纪80年代开始在分离纯化领域得到逐步应用，但利用免疫亲和层析来分离纯化河豚毒素尚未见报道，更无商品化的河豚毒素免疫亲和层析（介质）柱出售。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于河豚毒素分离纯化的免疫亲和层析介质。所述免疫亲和介质是由经活化后的固相载体与河豚毒素特异性抗体偶联而成。利用本发明所述免疫亲和介质填料装柱可制备成相应免疫亲和色谱柱，用于河豚毒素的分离纯化。

1、河豚毒素免疫亲和层析介质的制备。

本发明所述的免疫亲和介质是由经活化的固相载体与河豚毒素特异性抗体偶联而成。

（1）先将固相载体经溴化氰法（CNBr）活化。

（2）取河豚毒素特异性抗体与溶胀后的活化固相载体（湿凝胶）置于pH 6.0-7.5，0.1-0.5 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液中在室温下振荡偶联，其中抗体与溶胀后的活化固相载体的质量比为1: 100。

（3）将上述偶联凝胶产物转入其5-10 倍体积的pH 6.0-7.5，含有0.1-0.5 mol/L 醋酸的Tris-HCl缓冲液中，室温下振荡反应2 h进行封闭；最后用5-10 倍于封闭后凝胶体积的pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤2-4 次。

本发明所述的固相载体可为交联葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P）、交联琼脂糖（Sepharose）、多孔玻璃等。优选为交联琼脂糖（Sepharose CL-2B）。

本发明所述的河豚毒素特异性抗体是通过河豚毒素与载体蛋白的偶联物为免疫原来免疫动物得到的。其具体获得有两种途径：1、根据免疫学方法和程序自主制备；2、直接购买商品化河豚毒素特异性抗体。

2、利用本发明所提供免疫亲和层析介质制备成色谱柱用于河豚毒素纯化的方法，包括以下步骤。

（1）含有河豚毒素的样品前处理。

（2）河豚毒素免疫亲和层析柱的制备。

将得到的免疫亲和介质填充入固相萃取柱中，加入pH 6.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液后自然沉降，制成河豚毒素特异性抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用。