[发明专利]基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性血清、灭活苗免疫的阳性血清、感染的阳性血清、羊抗鸡IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板以I群禽腺病毒33K重组蛋白作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述I群禽腺病毒33K重组蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的33K基因片段编码。

3.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述I群禽腺病毒33K重组蛋白由基因工程菌株大肠杆菌DH5α体外诱导表达获得，该菌株含表达质粒pGEX-33K。

4.根据权利要求3所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述I群禽腺病毒33K重组蛋白的制备是以I群禽腺病毒代表株鸡胚致死孤儿病毒基因组为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后于pGEX-4T-1表达载体连接，构建原核表达载体pGEX-33K，将阳性重组菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中进行IPTG诱导表达，收集大量表达的重组宿主并超声裂解，用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析纯化得到目的蛋白；所述特异性引物为

上游引物CCGGAATTCTCTCTCCCTCATTTCT，

下游引物CCGCTCGA GCTTGATAGCATCGCTCTTC。

5.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至1～20μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于37℃温育1h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干；用封闭液封闭酶标板，200uL/孔，37℃孵育，封闭1h，用PBST洗板3次，拍干制得；所述封闭液为5％脱脂奶；所述包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述羊抗鸡IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。

7.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述阴性血清是以SPF鸡胚孵育所产2～5日龄雏鸡的血清；

所述灭活苗免疫的阳性血清是经I群禽腺病毒灭活苗两次皮下免疫后的SPF鸡血清；

所述感染的阳性血清是经I群禽腺病毒模拟自然感染的方式滴鼻、点眼两次后的SPF鸡血清；

所述洗涤液是含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4；

所述稀释液是1％BSA；

所述底物液是TMB-H₂O₂溶液；

所述终止液是2M H₂SO₄。

8.根据权利要求7所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液由NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，吐温-20 500uL，加蒸馏水定容至1000mL，调PH值到7.4制成；所述TMB-H₂O₂溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0.5ml、H₂O₂ 32ul组成；所述TMB缓冲液由Na₂HPO₄18.27g，柠檬酸4.665g，用900mL溶解，调PH至5.5，加水至1000mL制成；所述TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB 10mg制成。

9.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒在区分I群禽腺病毒感染产生的抗体与灭活苗免疫产生的抗体中的应用。

10.根据权利要求1所述的基于33K蛋白的FAVI抗体间接ELISA检测试剂盒在检测I群禽腺病毒感染的动物血清中33K蛋白抗体的应用。