[发明专利]液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌存在于自然界的空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。因此建立一种及时，快速，准确的检测金黄色葡萄球菌的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，用于检测金黄色葡萄球菌的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。

本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量；

捕获抗体与微球偶联形成偶联体

取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声10min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布；用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul 的微球原液置于1.5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 rpm，孵育2h，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4℃保存；

液相芯片检测金黄色葡萄球菌

将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球，加入10⁸ CFU/ml 的金黄色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床120rpm，1h，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10ul，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应1h，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100ul，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于100ul PBS-TBN中，上机进行检测。

本发明液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。运用液相芯片技术检测金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测，为食品安全做出贡献。

附图说明

图1是本发明捕获抗体最佳工作浓度；

图2是本发明灵敏度检测结果；

图3是本发明特异性的检测结果；

图4是本发明重复性检测结果；

图5是本发明在进行检测时所显示微球位置以及数量的实时图的点状图；

图6是本发明在进行检测时所显示微球位置以及数量的实时图的柱状图。

具体实施方式