[发明专利]牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及牡蛎折光马尔太虫检测领域，尤其是一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。

背景技术

折光马尔太虫(Marteilia refringens)对牡蛎养殖的危害较大，可引起贝类消瘦、消化道变色、停止生长并死亡，大洋洲和欧洲等国家其感染现象普遍存在。

折光马尔太虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起折光马尔太虫PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，，因而难以适应基层现场检测需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：

反应液A：含有10×等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、10mM dNTPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的环引物1、20uM的环引物2、5M甜菜碱、625μM钙黄绿素和12.5mM氯化锰；10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

内引物1序列为CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA，

内引物2序列为AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT，

外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC，

外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC，

环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG，

环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC。

反应液A每管24μL，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合酶8U/ul、3.5ul 10mM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM的环引物2，1ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和2.5ul双蒸水。

本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据折光马尔太虫共有的基因保守区(见序列表SEQ.ID.No.1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此发明了用于快速检测牡蛎折光马尔太虫的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎折光马尔太虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎折光马尔太虫。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。

另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性：一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了SYBR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。

附图说明

图1是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。

图1中：1折光马尔太虫，2单孢子虫，3副溶血弧菌，4溶藻弧菌，5派琴虫，6河弧菌，7贝类组织。

图2是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。