[发明专利]一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用

权利要求书

1.一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体，所述载体包括以下5’-3’方向的连接元件：

(1)开放阅读框1：包含依次排列的巨细胞病毒早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子序列；

(2)开放阅读框2：包含依次排列的巨细胞病毒早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列；

(3)筛选标记基因、猿猴病毒SV40终止子序列。

2.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1和开放阅读框2的巨细胞病毒早期启动子/增强子及内含子序列为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1的牛生长激素转录终止子序列为SEQ ID NO：2。

4.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框2的牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列为SEQ ID NO：3。

5.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述猿猴病毒SV40终止子序列为SEQ ID NO：4。

6.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点；所述开放阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点。

7.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因选自二氢叶酸还原酶基因。

8.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是由质粒Pcmob3H改造获得。

9.如权利要求8所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是在质粒Pcmob3H多克隆位点的SalI酶切位点和NheI酶切位点之间，自5’-3’方向插入所述开放阅读框1、开放阅读框2、筛选标记基因以及猿猴病毒SV40终止子序列。

10.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。

11.如权利要求10所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞选自CHO-K1或CHO-dhfr^-细胞株。

12.如权利要求1-11任一权利要求所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体在哺乳动物细胞表达蛋白中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述蛋白为抗体，包括一条重链和一条轻链。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述抗体为全人TNFα单克隆抗体，包括全人TNFα单克隆抗体的轻链和全人TNFα单克隆抗体的重链。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述全人TNFα单克隆抗体的轻链的DNA序列为SEQ ID NO：5，全人TNFα单克隆抗体的重链的DNA序列为SEQ ID NO：6。

16.一种装载有全人TNFα单克隆抗体基因的双顺反子表达载体，所述载体为在权利要求1-11任一权利要求所述双顺反子表达载体的基础上构建，其中，所述开放阅读框1的多克隆位点插入有全人TNα单克隆抗体轻链DNA序列，所述开放阅读框2的多克隆位点插入有全人TNFα单克隆抗体重链DNA序列。

17.如权利要求16所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述全人TNFα单克隆抗体的轻链DNA序列为SEQ ID NO：5，全人TNFα单克隆抗体的重链DNA序列为SEQ ID NO：6。

18.如权利要求16所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点，所述全人TNFα单克隆抗体轻链DNA序列插入于NheI酶切位点和MluI酶切位点之间；所述开放阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述全人TNFα单克隆抗体重链DNA序列插入于EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间。