[发明专利]一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及绵羊内脏组织蛋白的提取，将冰冻破碎匀浆法和漩涡混合法相结合，对绵羊内脏组织中的蛋白质进行高效提取，以绿色荧光蛋白基因表达验证其重要的实用价值。

背景技术

动物内脏组织是多种生物活性物质合成、代谢的场所，内含多种蛋白质，经常被用来检测生物活性物质以及某些蛋白的表达及其表达量。动物蛋白质在组织或细胞中一般以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，其提取和纯化是一项艰巨而复杂的任务；要从复杂的混合物中完全提取出某种动物蛋白质，尚无普遍适用的方法；但任何一种动物蛋白质都可以根据其物理、化学性质及生物学特性，通过实验摸索，选择一套合适的提纯程序获取高纯度的蛋白质。     

由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即使是同类蛋白质，因选用材料不同，提取方法差别也很大，不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离和提取；因此从动物组织中分离提取蛋白，建立快速、简便、重复性好的方法十分必要。

根据文献检索：①Nihan Burul-Bozkurt等在小鼠坐骨神经组织中加入裂解缓冲液（裂解液组成：20mM Tris HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，5mM MgCl₂，5mM DTT，1﹪SDS，1mM PMSF和cocktail蛋白酶抑制剂）进行组织匀浆，4℃、14,000转/分钟离心20min，分离上清，SDS-PAGE和Western-Blot检测芳香酶蛋白表达，在55 kD处检测到清晰的目的蛋白带。②专利号为CN 101252849A的《从结缔组织中分离蛋白质的系统和方法》的发明，公开了从结缔组织中分离肌肉蛋白质，通过包括肌肉组织和结缔组织的动物组织置于水性溶剂中生成浆液，然后该浆液在低剪切力环境下加速，能够从结缔组织中分离肌肉蛋白质，但该方法操作复杂，技术要求高。③2007年吴燕燕、王剑河，李来好等在《食品科学》2007,28(7):245-248.发表的“罗非鱼内脏蛋白酶超声波提取工艺的研究”以罗非鱼内脏为原料，用蒸馏水洗净，按1:5(W/V)加入0.02mol/L的磷酸缓冲液，匀浆破碎 , 将匀浆后的样品分别放置于4℃冰箱和超声波仪中处理一段时间，取出，匀浆液在4℃ 10000r/min离心30min，收集上清液为提取蛋白酶液。

本发明依据动物蛋白质的物理、化学性质及生物学特性，通过实验，选择一套合适的提纯程序获取高纯度的蛋白质；即将冰冻破碎匀浆法和漩涡混合法相结合，对绵羊内脏组织中的蛋白质进行高效提取，并对其体内表达水平进行Western blot免疫组化验证，具有重要的科学实践意义。

发明内容

本发明的目的在于：提供高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法 ，为绵羊内脏组织蛋白的提取和分析提供简便、高效、快速的技术方法，具较强的实用性。

本发明目的是这样实现的：一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，以绵羊肝、脾、肺、肾的内脏组织为样品，按细胞破碎、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤实施：

细胞破碎：称取20-25mg样品，剪成3mm×3mm的小块，置于预冷的2mL离心管中，其样品与裂解液的加量比为1:3-1:5；继续加入直径为4-5cm的无菌钢珠，置于TissueLyser  LT仪器中匀浆，匀浆40-50秒即粉碎，取出钢珠，置于冰盒中3分钟，在漩涡振荡器上涡旋10秒，再置于冰盒、再涡旋，反复6-8次，使其充分溶解；取匀浆液在4℃、14000转/分钟、离心25-30分钟，取上清得蛋白提取物；其中LT仪器在使用前先置于-70℃冰箱预冷;

蛋白定量：以BSA为对照，选用BCA法，依据多功能酶标仪的检测结果，制定标准曲线，以计算蛋白浓度将其定量；取定量蛋白100μg，加入等量2×上样 buffer，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白；

其中蛋白裂解液的配方：取9M尿素2.7克，质量体积比为4﹪3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.2克，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于-20℃冰箱中，使用前在裂解液中加入体积比为4﹪的蛋白酶抑制剂；

其中2×上样 buffer的配方：取20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH为8.0, 100mM二硫苏糖醇，2％十二烷基磺酸钠，20％丙三醇，0.016％溴酚蓝，依次加入试剂瓶中完全溶解后使用;