[发明专利]通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业领域，特别涉及矮牵牛通过花药培养获得再生植株的方法。

背景技术

矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)，又名碧科茄、灵芝牡丹，属茄科矮牵牛属的多年生草本植物，因其色彩丰富艳丽、品种繁多、花色多变、花期长、适应性强、粗放型管理，是当前我国优良的重要花坛绿化草花，亦可以作盆栽花卉。矮牵牛较为耐热是我国夏秋季节常用的绿化草花。由于矮牵牛具有明显的杂种优势，观赏性强，目前市面上销售的矮牵牛种子多为F1代，并且主要从国外进口。利用杂交优势进行杂交育种的关键是获得优良性状的纯系父母本(自交系)。为了获得自交系，按常规的自交方法，需要耗费大量的田间土地、时间和劳力，一般需要5-6年的时间，而且手续十分繁琐，最终的纯度也不够理想。而采用花药培养获得单倍体再加倍的方法，只需1年时间就可以获得和多代自交效果相同的纯系，可以极大地缩短杂交育种年限，提高育种效率(王成社，西安联合大学学报(自然科学自版)，2000，3(4)：7-10)。目前，有关矮牵牛花药培养的研究在国外有一定的研究基础，但在国内仅有3篇相关的论文报道，并且再生率相当低。此外，笔者按照其所述方法并没有得到经花药培养的矮牵牛再生植株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，通过本发明可对矮牵牛进行花药培养产生单倍体植株，再经常规的秋水仙素加倍或经自然加倍能够产生纯合自交系，可为矮牵牛通过杂交获得F1代种子提供优良的亲本材料。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法，依次包括以下步骤：

A)、低温预处理和消毒：选取矮牵牛花蕾，并于3～7℃中进行低温预处理2～4天；低温预处理后进行消毒处理；

B)、将步骤A)所得的花蕾用镊子剥去花萼和花瓣，取出花药，将花药去净花丝后接种在诱导愈伤组织培养基上；培养温度为25±1℃，培养条件为暗培养；每13～17天更换一次新鲜的诱导愈伤组织培养基，待愈伤组织形成后将愈伤组织转接到新鲜的诱导愈伤组织培养基上进行继代培养；继代培养至少2次；

C)、将步骤B)继代培养所得的愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化培养；培养室温度25±1℃，光照培养，光照强度为180～220μmol·m^-2·s^-1，光照时间为13～15h(一般可选择在5:00-19:00进行光照)；当所得的不定芽达到3～5cm时，停止分化培养；

上述分化培养一般需要4～6周，此时会形成较多的芽丛；

D、再生苗的生根培养：

将步骤C)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养，直至小苗上长出至少3条且长度≥2cm的不定根(一般需要20天左右)；得可出瓶种植的种苗，该可出瓶种植的种苗为再生植株；培养条件：25±1℃，需光培养，光照强度为200～300mol m^-2·s^-1；

上述步骤A)～D)均在无菌环境中进行。

作为本发明的通过花药培养获得矮牵牛再生植株的方法的改进：

诱导愈伤组织培养基为：Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0.5～2.0mg/L6-BA+0.2mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA，pH为5.8；

上述诱导愈伤组织培养基的制备方法为：在每L Nitsch基本培养基上添加7g的琼脂、20g的麦芽糖、0.5～2.0mg的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤，6-Benzylaminopurine)、0.2mg的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid)和0.5mg的NAA(α-萘乙酸，1-naphthlcetic acid)；然后用浓度为1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液调节pH值为5.8。

分化培养基为：Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0.1～0.5mg/LIBA+1.0～2.0mg/L 6-BA+水解酪蛋白0.5g/L，pH为5.8；或者为：Nitsch基本培养基+7g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0.1～0.5mg/L IBA+1.0～2.0mg/L TDZ(噻苯隆，thidiazuron)+水解酪蛋白0.5g/L，pH为5.8；