[发明专利]巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法

说明书

 

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种编码巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建方法，以及克隆、定点突变及其高效表达纯化方法。具体涉及对原始巨大芽孢杆菌的细胞色素P450酶基因进行生物信息学分析和基因的定向改造，以及重组酶的制备。

 

技术背景

细胞色素P450（cytochrome P450或CYP）为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。细胞色素P450酶分布广泛，至今已在各种动物、植物、真菌和细菌中都发现有其存在。（Estabrook R W,1996, FASEB J,10:202-204）

细胞色素P450酶基因多样性决定了其结构多样性和功能多样性。细胞色素P450酶的功能不仅降解化合物以获得碳源，而且还解毒外源化合物以及合成具生物学活性的化合物如甾醇、前列腺素和花生四烯酸酯代谢物。细胞色素P450酶也被用于基因治疗以补偿重要代谢途径缺损。另外，细胞色素P450酶可被用于使立体和位置选择性的化合物加单氧化作用以产生重要的生物活性(冷欣夫等,细胞色素P450酶系的结构功能与应用前景,2001）。细胞色素P450酶有如此多样的功能作用，体现出其生物学的重要性，可以预见细胞色素P450酶的应用具有广阔的前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内物质的代谢途径，改变产物的性质和数量。随着现代生物技术如基因工程技术的发展，人们可以操纵细胞色素P450酶基因的结构及其表达过程，由此改变细胞色素P450酶的活性，甚至构建具有天然细胞色素P450酶不具备的新活性。

在细菌细胞色素P450酶中，P450-BM3又称CYP102A1，能催化中长链脂肪酸的末端羟基化，它能够快速催化链长大约C12-C20的饱和或不饱和脂肪酸的单加氧酶活性（Urlacher V B, Appl Microbiol Biotechnol 64(2004):317-325）。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是细胞色素P450酶的高产菌株，其中巨大芽孢杆菌ALA2菌株所产生的细胞色素P450酶具有对不饱和脂肪酸超强的氧化催化能力（Hilker et al., 2007, Progress in Lipid Research 47(2008) :1-14）。但是，通过营养条件和培养条件的优化，巨大芽孢杆菌ALA2菌株所产的细胞色素P450酶不能满足工业上的需要，而且成本较高。研究表明，对细胞色素P450酶的基因进行克隆、改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高细胞色素P450酶性质的最有效方法（Daniel A et al., Biotechnology J,88(2001) :167-171）。到目前为止，在GenBank和DDJB数据库中虽然已有其他巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因序列被报道，国内外也有实现了细胞色素P450酶基因在大肠杆菌中表达的研究报道，但均未进行该基因的超量表达的研究。

大肠杆菌是目前应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。其遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济倍受遗传工程专家的重视。研究表明，外源蛋白在大肠杆菌中表达的差异主要由表达系统的选择及外源基因本身的特性决定。到目前为止，对巨大芽孢杆菌ALA2菌株细胞色素P450酶基因进行定向改造以及该重组酶的高效表达在国内外还未见研究报道。

 

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法，本发明大幅度提高了巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶的重组表达水平，获得能在大肠杆菌中超量表达的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶基因cypI及其重组质粒，及其重组酶的纯化方法。

技术方案：编码巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因，该基因的核苷酸序列cypI如SEQ ID NO.1所述。

包含上述核苷酸序列的重组质粒。

包含上述核苷酸序列的重组质粒pTrc99A-cypI。