[发明专利]一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种象耳豆根结线虫的检测方法与应用。

背景技术

植物根结线虫(Meloidogyne)是植物根系专性内寄生物，分布遍及世界大部分地区。因其适应性强、传播途径多样、可侵染多种植物，而成为世界性威胁农业生产的主要病原物，给农业生产者造成极大的经济损失。我国根结线虫种类繁多，分布广泛，除常见的南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫(M.hapla)和花生根结线虫(M.arenaria)4种主要的根结线虫外，近年来调查表明象耳豆根结线虫(M.enterolobii)在我国南方地区分布较广，并且危害严重。

象耳豆根结线虫是1983年报道于我国海南省儋州的一个新种，原始寄主是象耳豆树。近年来研究发现该线虫可以寄生豆科、茄科、葫芦科中的多种经济作物以及番石榴等热带水果，更为重要的是该线虫还可以侵染携带Mi抗性基因的番茄、辣椒、烟草等。2008年，象耳豆根结线虫首次在欧洲被报道。同年，EPPO报道在中国出口至欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO对该线虫进行风险评估，认为该线虫对中欧地区作物存在较大的风险。值得关注的是，Karssen等在2008年确认玛雅古根结线虫(M.mayaguensis)是象耳豆根结线虫的同种异名。玛雅古根结线虫在非洲、南北美洲及欧洲均有分布，可以寄生的寄主超过8科20种植物，是国际上公认的危害最大的根结线虫之一。可见象耳豆根结线虫已成为全球热带、亚热带地区作物的一个重要病原物，且可能影响到我国的国际贸易。

然而，常规鉴定方法很难对象耳豆根结线虫进行准确鉴定，因为象耳豆根结线虫的会阴花纹同南方根结线虫的会阴花纹非常相似。分子鉴定基本可满足象耳豆根结线虫的检测鉴定，但模板DNA均来自线虫。因此，探索新的灵敏度高的引物、能够直接对单个根结DNA进行稳定扩增从而实现对象耳豆根结线虫快速检测具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有象耳豆根结线虫快速检测技术的不足，提供一种新的象耳豆根结线虫单根结的检测方法。

本发明另一个目的是提供所述检测方法的应用。

本发明的技术问题通过下述技术方案予以实现：

提供一种象耳豆根结线虫单根结的检测方法，通过优化的聚合酶链反应检测象耳豆根结线虫，包括以下步骤：

(1)设计和合成引物；

(2)培养根结线虫，提取含有根结线虫的单根结DNA；

(3)以含有根结线虫的单根结DNA为模板进行PCR扩增反应；

(4)将PCR扩增反应反应产物进行脂糖电泳检测。

步骤(1)所述引物是根据植物线虫大亚基核糖体DNA(基因登录号为：AF435803、AF435794、AY446970、JN005857、FN429017、GQ375158、EU364890、EU570214、AF435793、AF435802、FJ485651、DQ328713、HQ688681、EU130893和EU368591)的D2D3设计一对根结线虫通用引物MF和MR；再根据根结线虫mtDNA COII和lrRNA基因(基因登录号为：FJ159631、AY635612、GQ266686、GQ266685、AY446970、GQ870255、AY757882、GQ865513、HM161680、AY635609、AY757909、AY942848、AY942851和EU364883)间区域种间差异设计一对扩增象耳豆根结线虫的特异性引物FMe和RMe。所述引物的核苷酸序列为：

MF：5’-GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGT-3’；

MR：5’-AACCGCTTCGGACTTCCACCAG-3’；

FMe：5’-CATTCATTTATACCAATTTTAGTTGAGG-3’；

RMe：5’-CAATTATTGAATATTTTTTCCCAAACGA-3’。

步骤(2)所述提取含有根结线虫的单根结DNA的步骤如下：

将单个根结放入加了45μl 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3～5min，短暂离心后95℃水浴10min，然后加入5μl1M Tris-HCl(pH值为8.0)，混匀，12,000g离心30s，直接进行下一步的PCR反应或-20℃保存备用。

步骤(3)所述扩增反应是以步骤(2)提取的DNA作为模板，采用双重PCR法进行扩增。