[发明专利]一种用于表达猪IFITM3基因的转基因猪的培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术和抗病育种领域。具体涉及一种具有抵抗动物病毒性疾病的转基因猪的培育方法，通过手工体细胞核移植技术制备表达猪源干扰素诱导跨膜蛋白3(swine interferon induced transmembrane 3，sIFITM3)基因的转基因猪。

背景技术

动物传染病流行是严重制约我国养殖业持续发展的主要原因，其流行的三个基本环节是传染源、传播途径和易感动物。控制传染源、切断传播途径和提高易感动物的抗病能力是动物传染病防控的基本措施，其中提高易感动物的抗病能力是根本。提高易感动物抗病能力主要途径是疫苗免疫和抗病育种。虽然疫苗免疫目前在保护易感动物方面发挥了重要的作用，但是仍然存在诸多的缺点，譬如：(1)对易变的RNA病毒免疫效果不佳，如2009年至今的亚洲口蹄疫，导致日本顶级宫崎牛几乎灭绝，其一定程度上是由于病毒出现较大的变异，疫苗免疫效果不佳或无效；(2)存在生物安全隐患，如2007年英国发生两起口蹄疫就是由于疫苗加工厂病毒逃逸；(3)疫苗免疫的高成本：疫苗从研发到应用的周期很长，而且需要随着病原的变异不断更新换代；大多数疫苗需要逐个动物多次接种，物力和人力成本均很高。通过抗病育种途径提高猪的抗病力，是避免养猪生产遭受疾病困扰的一种很有前景的方法(袁树楷等，2007)，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。

常规育种技术对抗病等复杂性状的分析较困难、选择效率较低、育种周期较长，已不能满足当前养殖业对抗病品种的需求。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。如果将疫苗免疫和抗病育种结合起来，必将有助于动物疫病控制和保障人类的健康。随着人类对动物传染病危害认识越来越深刻，目前国内外许多科学工作者都认识到了抗病育种的迫切性，通过现代分子技术阐明抗病力的遗传机理并结合分子育种进行抗病育种已经成为可能。越来越多的抗病育种候选基因被发掘并利用，1992年德国慕尼黑大学的Brem小组首次培育出小鼠流感抗性基因Mx1的转基因猪(Müller et al.，1992)。1994年Clements等将Visna病毒的衣壳蛋白基因(eve)转入绵羊，获得了对该病毒抗病能力明显提高的转基因羊。2000年，Kerr等将溶葡球菌酶基因转入小鼠乳腺中，获得抗乳腺炎转基因小鼠。后来，相继培育出抗乳房炎的转基因牛(Donovan et al.，2005)和山羊(Maga et al.，2006)。此外，在抗牛海绵状脑病和羊瘙痒病转基因动物研究方面也取得了显著进展。1993年，瑞士的Weissmann小组培育出对羊瘙痒病有抗性的PrP敲除小鼠(Büeler H et al.，1993)。后来，不同的科学家运用基因打靶技术相继培育出抗羊瘙痒病的克隆羊(Denning et al.，2001；Golding et al.，2006)和抗牛海绵状脑病的克隆牛(Kuroiwa et al.，2004；Golding et al.，2006；Richt et al.，2007)。

干扰素诱导跨膜基因(interferon induced transmembrane，IFITM)属于干扰素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)中一类较小的分子，包括IFITM 1～3，IFITM5和IFITM6，(Martensen et al.，2004；Fredy Siegrist et al.，2011)。IFITMs参与早期发育、细胞间黏着与分化、宿主免疫防御反应以及天然免疫相关的生物过程等功能(Saitou M et al.，2002；Siegrist F，et al.，2011)。Brass等利用RNAi库筛选鉴定出IFITM1～3为病毒的限制因子，主要影响病毒进入细胞阶段来有效抑制流感病毒、水疱性口炎病毒和WNV等虫媒病毒复制，其中IFITM3是最具有潜力的抑制病毒复制的宿主限制因子，其抗病毒谱越来越广泛(Brass et al,，2009；Jiang et al.，2010；Huang et al.，2011，Lu et al，2011)。