[发明专利]辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的特异引物对

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的特异引物对。

背景技术

橘小实蝇Bactrocera(Bactrocera)dorsalis(Hendel)，又名东方果实蝇，隶属于双翅目(Diptera)，实蝇科(Tephritidae)，果实蝇属(Bactrocera)。该虫寄主范围广，可危害柑橘、番石榴、杨桃等40多科250多种水果和蔬菜，是一种世界性检疫害虫。橘小实蝇从国外入侵到我国，在国内从南至北扩散，并且进一步扩散的趋势日趋严峻，对我国主要果品的出口构成了更大的威胁。目前，橘小实蝇主要分布于广东、广西、湖南、贵州、福建、海南、云南、四川、台湾等省区。广泛的分布，以及对我国农林生产和农业生态系统造成的严重危害，使得橘小实蝇的防治方法和入侵机制成为迫切需要解决的问题。

实蝇共生菌多是可以降解果胶的细菌和固氮菌，帮助宿主消化食物和进行碳氮循环；并最终通过影响交配、生殖和寿命，影响实蝇对环境的适应能力。此外，从实蝇当中分离到的共生菌还可以产生挥发性物质，对宿主具有一定的引诱能力，还可以作为宿主的食物。因此，研究橘小实蝇内共生菌以及其与宿主实蝇的协同入侵作用，对于切断实蝇的入侵途径，发现新的实蝇诱饵，提高不育实蝇的环境适应能力，进一步实现“抗菌防虫”，并发现新的实蝇防治方法具有重要意义。

传统实蝇共生菌的研究方法包括针对可培养菌的分离培养鉴定技术，针对不可培养菌的分子生物学技术以及显微成像技术。

分子生物学技术是针对不可培养共生菌发展起来的，主要包括共生菌16s rRNA基因文库的构建以及变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术。PCR-DGGE技术先提取实蝇体内宏基因组，通用引物扩增共生菌16s rRNA基因片段，然后通过DGGE电泳技术将不同序列的基因片段分开，测序，通过序列分析确定内共生菌的种类。该方法快速直观；便于不同个体或样品之间的比较，有利于找到其相同或相异共生菌。但由于电泳本身的缺陷，该方法只能分离500bp以下的片段，获得的序列信息不够全面；并且，同种共生菌可能具有不同的电泳条带；影响了该方法的准确性；此外，该技术操作繁琐，对操作人员技术水平要求较高。相比之下，构建16s rRNA基因文库可获得关于共生菌16s rDNA序列的详细信息，有利于对橘小实蝇共生菌做一个详细的筛查。

采用构建16s rRNA基因文库的方法来筛选橘小实蝇内共生菌种类，一般采用针对16s rDNA序列的通用引物(27F/1492R)，可扩增出所有细菌的长度约为1.5kb的16srDNA序列。因包含多种共生菌的16s rDNA序列，PCR产物直接测序时显示双峰，无法得到较好的实验结果。需要进一步将序列回收，连接到载体上，转化大肠杆菌，挑选已插入目的片段的阳性克隆进行测序。这一过程中，需挑选大量克隆进行菌落PCR并测序，才能检测到所有共生菌，方法繁琐复杂，灵敏度不高，极易忽略某类含量较低的共生菌。因此，提高共生菌检测灵敏度，优化对某种共生菌的检测方法成为橘小实蝇内共生菌研究的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的特异引物对。

本发明提供的辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的特异引物对，由序列表的序列1所示DNA(上游引物)和序列表的序列2所示DNA组成(下游引物)。

所述特异引物对可用于辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌。

所述特异引物对可用于制备辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的试剂盒，包括所述特异引物对。

本发明还保护一种辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的方法，包括如下步骤：以待测菌(真细菌或称细菌)的基因组DNA(或所述基因组DNA的稀释液)为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物待测菌为候选的肺炎克雷伯氏菌，如果没有得到PCR扩增产物待测菌为候选的非肺炎克雷伯氏菌。

所述PCR扩增产物的大小可为500bp-750bp，具体可为500bp-700bp，更具体可为558bp-565bp，优选为558bp。

所述PCR扩增的反应体系具体如下(50μL)：5μL 10×Reaction Buffer(含Mg²⁺)，4μL dNTP mixture(2.5mM)，Taq酶0.5μL(2.5U/μL)，ddH₂O 37.5μL，所述模板1μL，所述上游引物(10μM)1μL，所述下游引物(10μM)1μL。